Ex vivo Oculomotor segment cultuur van embryonale GFP-uitdrukken van muizen voor timelapse-beeldvorming van Oculomotor zenuw uitgroei

Het oculair motorsysteem biedt een elegant systeem voor het onderzoeken van Axon geleidings mechanismen. Het is relatief ongecompliceerd, bestaande uit drie craniale zenuwen innervating zes extraocular spieren (EOMs) die het oog bewegen, en de levator palpebrae superioris (LPS) die het ooglid liften. De Oculomotor zenuw innert de lp’s en vier eoms-de minderwaardige schuine en de mediale, inferieure en superieure rectus spieren. De andere twee zenuwen, de trochlear en kidnens, elk slechts innervate één spier, de superieure schuine en laterale rectus spier, respectievelijk. Oogbewegingen zorgen voor een gemakkelijke uitlezen, wat aangeeft of innervatie gepast, vermist of afwijkend is. Bovendien, er zijn menselijke oog bewegingsstoornissen die voortvloeien uit tekorten in neuronale ontwikkeling of Axon begeleiding, gezamenlijk aangeduid als de aangeboren craniale desinnervatie stoornissen (Cdd’s)¹.

Ondanks deze voordelen wordt het oculair motorsysteem zelden gebruikt in axon guidance studies^{2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10}, vanwege technische nadelen. In vitro axon begeleiding assays hebben vele nadelen¹¹. Co-cultuur assays, waarin neuronale explanten worden gekweekt samen met explantaten van doelweefsel¹² of getranssinfecteerde cellen¹³, afhankelijk van beide symmetrie van de explant en precieze positionering tussen de explant en het doelweefsel. Stripe assays^14,15, waarin twee signalen zijn vastgelegd in afwisselende strepen en axonen worden beoordeeld op preferentiële groei op één streep, geven alleen aan dat één substraat beter is dan de andere, niet dat het aantrekkelijk is of weerzinwekkend, of fysiologisch relevant. Microfluïdica kamers kunnen precieze chemische gradiënten vormen, maar het onderwerp groeit axonen om stress^16,17,18te afschuiven, wat hun groei kan beïnvloeden. Bovendien, in elk van deze benaderingen, het verzamelen van explanten of gezien cellen vereist dat de uitgroeiende axonen worden axotomized en dus deze tests onderzoeken axon regeneratie, in plaats van initiële axon uitgroei. Tot slot, deze in vitro benaderingen verwijderen van de micro-omgeving die invloed op axonen en hun reacties op hints langs verschillende punten van hun cursus, en traditioneel slechts één hint in isolatie te testen. Door deze nadelen te comperen, maakt de geringe omvang van elke Nucleus in het oculaire motorsysteem de dissectie technisch uitdagend voor zowel explantaten als gedisiteerde culturen. Bovendien zijn primaire culturen van oculaire motorneuronen meestal heterogeen, hebben significante celdood, en zijn dichtheids afhankelijke, waarbij het groeperen van cellen uit meerdere embryo’s vereist is (Ryosuki Fujiki, persoonlijke communicatie). In vivo methoden, met inbegrip van Knockout muismodellen, zijn echter ongeschikt om te gebruiken voor screening, gezien de tijd en kosten die nodig zijn.

Methoden die zijn ontwikkeld voor het kweken van hele embryo’s¹⁹ het labelen van cellen²⁰ of blokkade van specifieke moleculen²¹toestaan, maar hele embryo culturen vereisen incubatie in roller flessen die real-time beeldvorming van gelabelde Structuren. Chirurgische technieken die manipulatie van het embryo mogelijk maken en vervolgens verdere ontwikkeling in de baarmoeder of in de buik van de moeder (het handhaven van de placentaire verbinding)²² kunnen ook worden uitgevoerd, maar deze laten ook geen time-lapse Imaging.

Om de obstakels van in vitro testen te overwinnen en een snelle screening van signalerings trajecten mogelijk te maken, werd een ex vivo embryonale segment kweek techniek ontwikkeld²³, aangepast van een eerder gepubliceerd protocol voor perifere zenuw groei²⁴. Met behulp van dit protocol, de ontwikkelende Oculomotor zenuw kan worden afgebeeld in de tijd in de aanwezigheid van veel van de omringende structuren langs haar traject, met inbegrip van EOM targets. Door kleine molecuul remmers, groeifactoren of geleidings signalen aan de cultuur media toe te voegen, kunnen we geleidings verstoringen op meerdere punten langs het axon-traject beoordelen, waardoor een snellere beoordeling van potentiële groei-en geleidings factoren mogelijk is.