Bildung von Human Periodontal ligament Cell Spheroids auf Chitosan Filmen
Summary
Hier präsentieren wir Protokolle zur Kultivierung von Humanparodontalband (PDL) Zellsphäriden durch Chitosan-Filme. Die Kultur der dreidimensionalen (3D) zellulären Sphäroide bietet eine Alternative zum herkömmlichen Gewebekulturpolystyrol (TCPS) Kultursystem.
Abstract
Parodontalbandzellen (PDL) sind für die Regeneration des parodontalen Gewebes vielversprechend. Üblicherweise werden PDL-Zellen auf zweidimensionalen (2D) Substraten wie Gewebekulturpolystyrol (TCPS) kultiviert. Jedoch, charakteristische Veränderungen der PDL-Zellen wurden während der In-vitro-Kultur beobachtet. Dieses Phänomen liegt wahrscheinlich daran, dass sich das 2D TCPS von der dreidimensionalen (3D) Mikroumgebung in vivo unterscheidet. Im Vergleich zu Zellen, die auf 2D-Substraten kultiviert werden, weisen Zellen, die in einer 3D-Mikroumgebung angebaut werden, mehr Ähnlichkeiten mit In-vivo-Zellen auf. Daher bieten 3D-Zellkulturmodelle eine vielversprechende Alternative zur konventionellen 2D-Monolayer-Zellkultur. Um herkömmliche PDL-Zellkulturmodelle zu verbessern, haben wir vor kurzem eine 3D-Zellkulturmethode entwickelt, die auf der Sphäroidbildung von PDL-Zellen auf Chitosan-Filmen basiert. Hier präsentieren wir detaillierte Zellsphäroid-Kulturprotokolle, die auf Chitosan-Filmen basieren. Das 3D-Kultursystem der PDL-Zellsphäriden überwindet einige der Einschränkungen im Zusammenhang mit der konventionellen 2D-Monolayer-Zellkultur und eignet sich daher möglicherweise für die Herstellung von PDL-Zellen mit einer verbesserten therapeutischen Wirksamkeit für die zukünftige parodontale Geweberegeneration.
Introduction
Parodontitis, vor allem durch Zahnbelag1initialisiert, ist durch die Schädigung von Parodontalgewebe einschließlich Parodontalband (PDL), Alveolarknochen und Zement um gekennzeichnet. Aktuelle Behandlungen für Parodontitis sind in der Regel erfolgreich bei der Verhinderung des Fortschreitens der aktiven Krankheit, aber die Regeneration von verlorenen parodontalen Geweben bleibt eine klinische Herausforderung. In jüngster Zeit wurden wichtige Fortschritte bei zellbasierten Ansätzen für die parodontale Geweberegeneration erzielt, um die Nachteile der aktuellen Behandlungen2,3,4zu überwinden.
Unsere vorherige systematische Überprüfung ergab, dass PDL-Zellen ein großes Potenzial für die parodontale Regeneration zeigten5. Üblicherweise werden PDL-Zellen auf zweidimensionalen (2D) Substraten wie Gewebekulturpolystyrol (TCPS) kultiviert. Während der In-vitro-Kultur6wurden jedoch charakteristische Veränderungen von PDL-Zellen beobachtet. Dieses Phänomen liegt wahrscheinlich daran, dass sich der 2D TCPS von der dreidimensionalen (3D) Mikroumgebung in vivo unterscheidet7. Im Vergleich zu Zellen, die auf 2D-Substraten kultiviert werden, weisen Zellen, die in einer 3D-Mikroumgebung angebaut werden, mehr Ähnlichkeiten mit in vivo Zellenauf 8. Daher bieten 3D-Zellkulturmodelle eine vielversprechende Alternative zur konventionellen 2D-Monolayer-Zellkultur.
Herkömmliche 3D-Kulturmethode ist das Verkapseln von Zellen in 3D-Biomaterialien. Im Vergleich zu Zellen, die in 3D-Biomaterialien eingekapselt sind, imitieren zelluläre Sphäroide die In-vivo-Situation genauer, da Sphäroide Aggregate von Zellen sind, die frei von Fremdstoffen wachsen9,10,11, 12. Es wird berichtet, dass zelluläre Sphäroide MSC-Bioaktivitäten durch die Erhaltung von extrazellulären Matrixkomponenten (ECM) einschließlich Fibronectin und Laminin13förderten. Zur Verbesserung herkömmlicher PDL-Zellkulturmodelle haben wir vor kurzem eine 3D-PDL-Zellkulturmethode entwickelt, die aufder Sphäroidbildung von PDL-Zellen auf Chitosan-Filmen 14 basiert. Die Sphäroidbildung erhöhte die Selbsterneuerung und die osteogene Differenzierungsfähigkeit der PDL-Zellen14. Hier präsentieren wir detaillierte PDL-Zellsphäroid-Kulturprotokolle, die auf Chitosan-Filmen basieren. Das 3D-Kultursystem von PDL-Zellsphäriden beseitigt einige der Mängel im Zusammenhang mit der konventionellen TCPS-Zellkultur und eignet sich daher möglicherweise für die Herstellung von PDL-Zellen mit einer verbesserten therapeutischen Wirksamkeit für die zukünftige parodontale Geweberegeneration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorliegende Studie führte ein 3D-Zellkultursystem ein, um einige Einschränkungen im Zusammenhang mit konventioneller 2D-Monolayer-Zellkultur zu überwinden. Nach dem Protokoll, PDL zelluläre Sphäroide wurden erfolgreich durch die Kultivierung von Zellen auf Chitosan-Filme gebildet. Unsere vorherige Studie berichtete, dass die Sphäroidbildung die Selbsterneuerungs- und osteogene Differenzierungskapazitäten von PDL-Zellen14erhöht hat. Anstatt ein Enzym zu verwenden, um Zellen aus TCPS zu …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (NSFC 81700978), Fundamental Research Funds for the Central Universities (1504219050), Natural Science Foundation of Shanghai (17ZR1432800) und Dem Shanghai Medical Exploration Project ( 17411972600).
Materials
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
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