キトサン膜上のヒト歯周靭帯細胞スフェロイドの形成
Summary
ここでは、ヒト歯周靭帯(PDL)細胞スフェロイドをキトサン膜で培養するプロトコルを紹介する。三次元(3D)細胞スフェロイドの培養は、従来の組織培養ポリスチレン(TCPS)培養システムに代わるものとなる。
Abstract
歯周靭帯(PDL)細胞は、歯周組織再生に大きな期待を持っています。従来、PDL細胞は、組織培養ポリスチレン(TCPS)などの2次元(2D)基板上で培養される。しかしながら、インビトロ培養中にPDL細胞の特徴的な変化が観察されている。この現象は、2D TCPS がインビボ 3 次元 (3D) マイクロ環境と異なるためと考えられます。2D基板で培養した細胞と比較して、3D微小環境で増殖した細胞は、生体内細胞とより類似性を示します。したがって、3D細胞培養モデルは、従来の2D単層細胞培養に有望な代替手段を提供する。従来のPDL細胞培養モデルを改善するために、キトサンフィルム上のPDL細胞のスフェロイド形成に基づく3D細胞培養法を最近開発した。ここでは、キトサンフィルムに基づく詳細な細胞スフェロイド培養プロトコルを紹介する。PDL細胞スフェロイドの3D培養システムは、従来の2D単層細胞培養に関連する制限の一部を克服し、したがって、将来の歯周組織再生のための高められた治療効果を有するPDL細胞の産生に適している可能性がある。
Introduction
歯周炎は、主に歯垢1によって初期化され、歯周靭帯(PDL)、肺胞骨、およびセメントを含む歯周組織の損傷によって特徴付けされる。歯周炎の現在の治療は、通常、活動性疾患の進行を防ぐことに成功しているが、失われた歯周組織の再生は臨床的な課題のままである。近年、歯周組織再生のための細胞ベースのアプローチにおいて、現在の治療2、3、4の欠点を克服するための重要な進歩がなされている。
我々の以前の系統的レビューは、PDL細胞が歯周再生5に大きな可能性を示したことを明らかにした。従来、PDL細胞は、組織培養ポリスチレン(TCPS)などの2次元(2D)基板上で培養される。しかしながら、インビトロ培養6の間にPDL細胞の特徴的な変化が観察されている。この現象は、2D TCPS がインビボ 3 次元 (3D) マイクロ環境7と異なるためと考えられます。2D基板上で培養された細胞と比較して、3D微小環境で増殖した細胞は、生体内細胞8とより類似性を示す。したがって、3D細胞培養モデルは、従来の2D単層細胞培養に有望な代替手段を提供する。
従来の3D培養法は、細胞を3Dバイオマテリアルに封入する。3Dバイオマテリアルに封入された細胞と比較して、細胞スフェロイドは、異物9、10、11を含まない細胞の凝集体であるため、生体内の状況をより密接に模倣する。12.細胞スフェロイドは、フィブロネクチンおよびラミニン13を含む細胞外マトリックス(ECM)成分の保存を介してMSC生物活性を促進したと報告されている。従来のPDL細胞培養モデルを改善するために、キトサンフィルム14上のPDL細胞のスフェロイド形成に基づく3D PDL細胞培養法を最近開発した。スフェロイド形成は、PDL細胞14の自己再生および骨形成分化能力を増加させた。ここでは、キトサン膜に基づく詳細なPDL細胞スフェロイド培養プロトコルを紹介する。PDL細胞スフェロイドの3D培養システムは、従来のTCPS細胞培養に関連する欠点の一部を克服し、したがって、将来の歯周組織再生のための高められた治療効果を有するPDL細胞の産生に適している可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、従来の2D単層細胞培養に関するいくつかの制限を克服するために、3D細胞培養システムを導入した。プロトコルによると、PDL細胞スフェロイドはキトサンフィルム上の細胞を培養することによって正常に形成された。我々の以前の研究は、スフェロイド形成がPDL細胞14の自己再生および骨形成分化能力を増加させたことを報告した。TCPSから細胞を採取するために…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国立自然科学財団(NSFC 81700978)、中央大学基礎研究基金(1504219050)、上海自然科学財団(17ZR1432800)、上海医療探査プロジェクト()17411972600)。
Materials
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
References
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. 암 연구학. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
