Isolatie van lamina propria mononucleaire cellen van Murine Colon met behulp van Collagenase E

Hoewel de gastro-intestinale (GI) tractus is voornamelijk gewijd aan de verwerking en reabsorptie van voedingsstoffen uit voedsel, het GI-tractus onderhoudt ook centrale rollen in de integriteit van de vasculaire, lymfatische, en zenuwstelsel en van tal van andere organen via het mucosale en submucosale immuunsysteem¹. Het GI-immuunsysteem heeft een invloedrijke rol in zowel de gastro-intestinale en systemische gezondheid als gevolg van de constante blootstelling aan buitenlandse antigenen uit voedsel, commensale bacteriën, of binnenvallende pathogenen^1,2. Zo moet het GI-immuunsysteem een delicaat evenwicht behouden waarin het niet-pathogene antigenen tolereert terwijl het adequaat reageert op pathogene antigenen^1,2. Wanneer de balans van tolerantie en verdediging wordt verstoord, gelokaliseerde of systemische immuun disregulatie en ontsteking kan optreden resulterend in een groot aantal ziekten^1,2,3.

De darm herbergt ten minste 70% van alle lymfoïde cellen in het lichaam⁴. De meeste primaire immunologische interacties betreffen ten minste één van de drie immuunstations in de darm: 1) Peyer’s patches, 2) Intraepitheliale lymfocyten (IEL) en 3) lamina propria lymfocyten (LPL). Elk van deze bestaat uit een complex verbonden netwerk van immuuncellen die snel reageren op normale immuunproblemen in de darm⁵. Beperkt tot de stroma boven de Muscularis mucosae, de losjes gestructureerde lamina propria is het bindweefsel van het darm slijmvlies en omvat steigers voor de villus, de vasculatuur, lymfedrainage, en mucosale zenuwstelsel, evenals vele aangeboren en adaptieve immune deelverzamelingen^6,7,8,9. LPL bestaat uit CD4⁺ -en CD8⁺ T-cellen in een geschatte verhouding van 2:1, plasmacellen en myeloïde Lineage cellen, waaronder dendritische cellen, mestcellen, eosinofielen en macrofagen⁶.

Er is een groeiende belangstelling voor het begrijpen van de immuun disregulatie en ontsteking van de darm als het betrekking heeft op verschillende ziektetoestanden. Dergelijke aandoeningen als de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa manifesteren alle verschillende niveaus van Colon ontsteking^10,11,12. Bovendien kunnen patiënten met maligne of niet-maligne aandoeningen van het merg of het immuunsysteem die een allogene beenmergtransplantatie ondergaan (Allo-BMT) verschillende vormen van colitis ontwikkelen, waaronder 1) directe toxiciteit van conditionerings regimes vóór BMT, 2) infecties veroorzaakt door immunosuppressie na BMT en 3) Graft-versus-hostziekte (gvhd) die wordt aangedreven door donor-type T cellen die reageren op donor Allo-antigenen in de weefsels na BMT^13,14,15. Al deze complicaties na BMT resulteren in significante veranderingen in het immuunmilieu van de darmen^16,17,18. De voorgestelde methode maakt een betrouwbare beoordeling van de accumulatie van immune cellen in de muis Colon mogelijk en, wanneer toegepast op muriene ontvangers na BMT, vergemakkelijkt een efficiënte assay van zowel donor-als ontvangende immuuncel die betrokken zijn bij transplantatie tolerantie^{19 ,20}. Extra oorzaken van ontsteking van de darm zijn maligniteiten, voedselallergieën, of verstoring van het microbioom van de darmen. Dit protocol biedt toegang tot de darm mononucleaire cellen van de dikke darm en, met wijzigingen, aan leukocyten van de dunne darm in een van deze preklinische Murine modellen.

Een PubMed zoeken met behulp van de zoektermen “darm en immune cel en isolatie” onthult meer dan 200 publicaties beschrijven methoden voor de spijsvertering van de dunne darm om immune cellen te extraheren. Echter, een soortgelijke literatuur zoeken naar Colon levert geen goed afgebakende protocollen specificeren isolatie van immune cellen van de dikke darm. Dit kan zijn omdat de dikke darm meer gespierde en interstitiële lagen heeft, waardoor het moeilijker om volledig te verteren dan de dunne darm. In tegenstelling tot bestaande protocollen, gebruikt dit protocol specifiek Collagenase E van Clostridium histolyticum zonder andere bacteriële collagenasen (Collagenase D/Collagenase I). We tonen aan dat, met behulp van dit protocol, de vertering van het Colon weefsel kan worden bereikt met behoud van de kwaliteit van geïsoleerde gut mononucleaire immuuncellen (MNC) zonder toevoeging van anti klonter reagentia zoals natrium versenate (EDTA), Dispase II, en deoxyribonuclease i (DNase i)^21,22,23. Dit protocol is geoptimaliseerd om toe te staan reproduceerbare robuuste extractie van levensvatbaar MNC van de Murine Colon voor verdere gerichte studies en moet zich lenen voor de studie van immunologie van de dikke darm of (met modificaties) de dunne darm^{24, 25}.