عزل الخلايا أحادية اللامينا بروبريا أحادية النونافة من القولون المورين باستخدام Collagenase E

على الرغم من أن الجهاز الهضمي (GI) مخصص في المقام الأول لمعالجة وإعادة امتصاص المواد الغذائية من المواد الغذائية، فإن الجهاز الهضمي يحافظ أيضا على أدوار مركزية في سلامة الأوعية الدموية، اللمفاوية، والجهاز العصبي والعديد من الأجهزة الأخرى من خلال في الغشاء المخاطي والجهاز المناعي تحت المخاطية¹. الجهاز المناعي GI له دور مؤثر في كل من الجهاز الهضمي والصحة الجهازية بسبب تعرضه المستمر للمستضدات الأجنبية من الغذاء، والبكتيريا commensal، أو مسببات الأمراض الغازية^1،2. وهكذا، يجب على الجهاز المناعي GI الحفاظ على توازن دقيق الذي يتسامح مع المستضدات غير المسببة للأمراض في حين تستجيب بشكل مناسب للمستضدات المسببة للأمراض^1،2. عندما يتم تعطيل توازن التسامح والدفاع، يمكن أن يحدث خلل التنظيم المناعي الموضعي أو الجهازي والالتهاب مما يؤدي إلى عدد لا يحصى من الأمراض^1،2،3.

الأمعاء تأوي ما لا يقل عن 70٪ من جميع الخلايا اللمفاوية في الجسم⁴. معظم التفاعلات المناعية الأولية تنطوي على واحدة على الأقل من ثلاث محطات المناعة في الأمعاء: 1) بقع باير، 2) الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة (IEL) و 3) الخلايا الليمفاوية لامينا بروبريا (LPL). يتكون كل من هذه من شبكة معقدة مترابطة من الخلايا المناعية التي تستجيب بسرعة للتحديات المناعية الطبيعية في الأمعاء⁵. يقتصر على ستروما فوق الغشاء المخاطي العضلي، وpropria لامينا منظم بشكل فضفاض هو النسيج الضام من الغشاء المخاطي للمعوة الأمعاء ويشمل السقالات للزغب، والأوعية الدموية، والصرف اللمفاوي، والجهاز العصبي المخاطي، فضلا عن العديد من الفطرية والمجموعات الفرعية المناعيةالتكيفية^6و7و8و9. وتتألف LPL من CD4⁺ وCD8⁺ T الخلايا في نسبة تقريبية من 2:1، خلايا البلازما وخلايا النسب النخاعي بما في ذلك، الخلايا التقشرية، والخلايا الصاري، الحمضات والضامة⁶.

هناك اهتمام متزايد في فهم خلل التنظيم المناعي والتهاب الأمعاء لأنها تتعلق بحالات المرض المختلفة. مثل أمراض كرون والتهاب القولون التقرحي كل ذلك يظهر مستويات متفاوتة من التهاب القولون^10،11،12. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرضى الذين يعانون من اضطرابات خبيثة أو غير خبيثة في النخاع أو الجهاز المناعي الذين يخضعون لزراعة نخاع العظم الالوجيني (allo-BMT) تطوير أشكال مختلفة من التهاب القولون بما في ذلك 1) السمية المباشرة من أنظمة تكييف قبل BMT، 2) العدوى الناجمة عن كبت المناعة بعد BMT و 3) الكسب غير المشروع مقابل مرض المضيف (GVHD) مدفوعا الخلايا T من النوع المانح ة رد فعل على المستضدات المانحة في الأنسجة بعد BMT^13،14،15. كل هذه المضاعفات ما بعد BMT يؤدي إلى تغييرات كبيرة في الوسط المناعي للأمعاء^16،17،18. تسمح الطريقة المقترحة بتقييم يمكن الاعتماد عليه لتراكم الخلايا المناعية في القولون الفأر، وعندما تطبق على متلقي المورين بعد BMT، تسهل فحص كفاءة لكل من الخلايا المناعية المانحة والمتلقية المشاركة في تحمل زرع^{19 ،20}. وتشمل الأسباب الإضافية لالتهاب الأمعاء الأورام الخبيثة، والحساسية الغذائية، أو اضطراب ميكروبيوم الأمعاء. يسمح هذا البروتوكول بالوصول إلى الخلايا أحادية النووية في الأمعاء من القولون، ومع التعديلات، إلى الكريات البيض في الأمعاء الدقيقة في أي من هذه النماذج المارين قبل السريرية.

بحث PubMed باستخدام مصطلحات البحث “الأمعاء والخلية المناعية والعزلة” يكشف أكثر من 200 منشورات تصف أساليب هضم الأمعاء الدقيقة لاستخراج الخلايا المناعية. ومع ذلك، فإن البحث عن الأدب مماثلة للقولون لا تسفر عن بروتوكولات محددة جيدا تحديد عزل الخلايا المناعية من القولون. قد يكون هذا لأن القولون لديه طبقات أكثر العضلات والخلالية، مما يجعل من الصعب هضم تماما من الأمعاء الدقيقة. على عكس البروتوكولات القائمة، يستخدم هذا البروتوكول على وجه التحديد كولاجيناز E من الهتستيك Clostridium دون الكولاجين البكتيرية الأخرى (Collagenase D / Collagenase I). نحن نثبت أنه، باستخدام هذا البروتوكول، يمكن تحقيق هضم الأنسجة القولونية مع الحفاظ على نوعية الخلايا المناعية أحادية النووية الأمعاء المعزولة (MNC) دون إضافة الكواشف المضادة للتكتل مثل فيرسنال الصوديوم (EDTA)، Dispase II، و ديوكسيريبونوكليس 1 (DNAse I)^21،22،23. تم تحسين هذا البروتوكول للسماح باستخراج قوي قابل للاستنساخ من MNC قابلة للحياة من القولون مورين لمزيد من الدراسات الموجهة، وينبغي أن تصلح لدراسة المناعة من القولون أو (مع التعديلات) الأمعاء الدقيقة^{24، 25}.