Elektrofysiologisk innspillinger av single-Cell ion strømninger under godt definert skjær stress
Summary
Målet med denne protokollen er å beskrive en modifisert parallell plate Flow kammer for bruk i å undersøke sanntids aktivering av mechanosensitive ion kanaler ved skjær stress.
Abstract
Fluid skjær stress er godt kjent for å spille en viktig rolle i endothelial funksjon. I de fleste vaskulære senger, utløser forhøyet skjær stress fra akutte økninger i blodstrømmen en signalering Cascade resulterer i vasodilatasjon dermed lindre mekaniske påkjenninger på vaskulær veggen. Mønsteret av skjær stress er også godt kjent for å være en kritisk faktor i utviklingen av aterosklerose med laminær skjær stress blir atheroprotective og forstyrret skjær stress blir Pro-atherogenic. Mens vi har en detaljert forståelse av de ulike mellomliggende celle signalering trasé, reseptorene som først oversette den mekaniske stimulans i kjemiske meglere er ikke helt forstått. Mechanosensitive ion kanaler er avgjørende for responsen til skjær og regulere skjær-indusert celle signalering dermed kontrollere produksjonen av vasoactive meglere. Disse kanalene er blant de tidligste aktiverte signalering komponenter for å skjære og har vært knyttet til skjær-indusert vasodilatasjon gjennom fremme nitrogenoksid produksjon (f. eks innvendig rectifying K+ [KIR] og forbigående reseptor potensial [TRP] kanaler) og endotelet hyperpolarizing faktor (for eksempel Kir og kalsium-aktiverte K+ [KCa] kanaler) og skjær-indusert vasokonstriksjon gjennom en ubestemt mekanisme som involverer piezo kanaler. Forstå Biofysiske mekanismen som disse kanalene aktiveres av skjærkrefter (dvs. direkte eller gjennom en primær mechano-reseptor) kan gi potensielle nye mål å løse patofysiologi forbundet med endothelial dysfunksjon og atherogenesis. Det er fortsatt en stor utfordring å registrere Flow-indusert aktivering av ion-kanaler i sanntid ved hjelp av elektrofysiologi. Standardmetodene for å eksponere celler til veldefinerte skjær stress, slik som kjegle og plate rheometer og lukket parallell plate Flow kammer ikke tillater sanntids studie av ion kanal aktivering. Målet med denne protokollen er å beskrive en modifisert parallell plate Flow kammer som gjør at sanntid elektrofysiologisk innspillingen av mechanosensitive ion kanaler under veldefinerte skjær stress.
Introduction
Hemodynamisk tyrker generert av blodgjennomstrømningen er velkjent for å spille store roller i endothelial og vaskulær funksjon1,2. Det er også velkjent at flere typer ion-kanaler akutt svare på endringer i skjær stress3,4,5 fører til hypotesen om at ion-kanaler kan være primære skjær stress sensorer. Mer nylig, vi og andre viste at mechanosensitive ion kanaler spille kritiske roller i flere skjær-stress sensitive vaskulære funksjoner, inkludert vasoactive respons på skjær stress6,7,8 , og utviklingsmessige angiogenese9. Mekanismene for skjær-stress følsomhet for ion-kanaler, men er nesten helt ukjent. Dette gapet av kunnskap er sannsynlig å være på grunn av de tekniske vanskelighetene med å utføre elektrofysiologisk innspillinger under veldefinerte skjær stress. I denne artikkelen, derfor gir vi en trinnvis detaljert protokoll rutinemessig utført i laboratoriet vårt for å oppnå dette målet6,7,10,11.
Det overordnede målet med denne metoden er å la sanntids undersøkelse av ion Channel mechanoactivation under veldefinerte skjær stress i det fysiologiske området. Dette oppnås ved å endre en standard parallell plate Flow kammer å tillate en elektrofysiologisk pipette skal senkes ned i kammeret og få tilgang til celler dyrket på bunnplaten under sanntid eksponering for flyt, og gir en unik tilnærming for å oppnå dette målet6,7,11. I kontrast kan standard parallell plate strømnings kamre, beskrevet i tidligere publikasjoner, brukes til bildeanalyse i sanntid av celler som utsettes for skjærkraft12 eller andre ikke-invasive tilnærminger13,14 , men ikke for elektrofysiologi. Tilsvarende kjegle og plate apparat, en annen kraftfull tilnærming for å utsette celler for å skjære stress15,16 er heller ikke egnet for elektrofysiologisk innspillinger. Dermed gjør disse flyt enheter ikke tillater etterforskning av skjær stress følsomhet for ion-kanaler. Vanskeligheten med å utføre elektrofysiologisk opptak under Flow er hovedårsaken til mangelen av informasjon om mekanismene som er ansvarlige for disse avgjørende effektene.
I forhold til alternative tilnærminger for å oppnå samme mål, er det ingen som er så nøyaktig eller kontrollert. Noen tidligere studier forsøkte å registrere ion Channel aktivitet under Flow ved å utsette celler til en strøm av væske som kommer fra en annen pipette brakt til nærheten av en celle fra over17,18. Dette er svært ikke-fysiologiske, som mekaniske krefter generert under disse forholdene har lite til felles med de fysiologiske profiler av skjær stress i blodkarene. Lignende bekymringer gjelder for forsøk på å simulere fysiologiske skjær stress ved å rekke åpne kamre. Som beskrevet i detalj i vår tidligere studie10, en åpen væske-luft-grensesnitt skaper flere forstyrrelser og resirkulering, som er ikke-fysiologiske. For å løse alle disse bekymringene, har vi utviklet en modifisert parallell plate (MPP) Flow Chamber, også referert til som “minimalt invasiv Flow Device” i våre tidligere studier6,7,10,11, laget fra akryl og mye brukt i laboratoriet vårt. Men til tross for det faktum at den opprinnelige beskrivelsen av design har blitt publisert nesten 20 år siden, og er den eneste flyten enhet som gjør det mulig å utføre elektrofysiologisk innspillinger under veldefinerte skjær stress, har denne metodikken ikke vært vedtatt av andre laboratorier og det er bare svært få studier som forsøker å ta opp strømninger underflyt. Vi tror derfor at å gi en detaljert beskrivelse for bruk av MPP Flow kammeret vil være til stor hjelp for forskere som er interessert i mechanosensitive ion kanaler og vaskulær biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det vaskulære systemet er stadig utsatt for aktive hemodynamisk tyrker, som aktiverer mechanosensitive ion kanaler3,22 men fysiologiske roller av disse kanalene i skjær stress-indusert mechanotransduction er bare begynner å dukke opp4,6,8. Mekanismene ansvarlig for mechanosensitivity av skjær stress-aktiverte kanaler forblir ukjent. Protokollen detaljert her beskrive…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av National Heart, Lung, og Blood Institute (R01 HL073965, IL) og (T32 HL007829-24, ISF). Forfatterne vil også erkjenne Scientific Machine Shop ved University of Illinois i Chicago for å generere vår nyeste MPP Flow kamre.
Materials
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?. Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of ‘Shear Rings’: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
