अच्छी तरह से परिभाषित शीर तनाव के तहत एकल कोशिका आयन धाराओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य कतरनी तनाव से mechanosensitive आयन चैनलों की वास्तविक समय सक्रियण की जांच में उपयोग के लिए एक संशोधित समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष का वर्णन है.
Abstract
द्रव कतरनी तनाव endothelial समारोह में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है. सबसे संवहनी बिस्तरों में, रक्त प्रवाह में तीव्र वृद्धि से ऊंचा कतरनी तनाव एक संकेत झरना ट्रिगर करता है जिसके परिणामस्वरूप वासोडिलेशन होता है जिससे संवहनी दीवार पर यांत्रिक तनाव को समाप्त किया जाता है। कतरनी तनाव के पैटर्न भी अच्छी तरह से लेमिनर कतरनी तनाव के साथ atherosclerosis के विकास में एक महत्वपूर्ण कारक होने के लिए जाना जाता है atheroprotective जा रहा है और परेशान कतरनी तनाव समर्थक atherogenic जा रहा है. जबकि हम विभिन्न मध्यवर्ती सेल संकेतन रास्ते की एक विस्तृत समझ है, रिसेप्टर्स कि पहले रासायनिक मध्यस्थों में यांत्रिक उत्तेजना अनुवाद पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं. मेकेनोसेन्सेटिव आयन चैनल कतरनी की प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण होते हैं और कतरनी-प्रेरित सेल संकेतन को विनियमित करते हैं जिससे वासोएक्टिव मध्यस्थों के उत्पादन को नियंत्रित किया जा सकता है। इन चैनलों जल्द से जल्द सक्रिय संकेत घटककतरा के बीच में हैं और नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन को बढ़ावा देने के माध्यम से कतरनी प्रेरित vasodilation से जोड़ा गया है (जैसे, अंदर से सुधार K+ [कीर] और क्षणिक रिसेप्टर क्षमता [टीआरपी] चैनल) और endothelium hyperpolarizing कारक (जैसे, किर और कैल्शियम सक्रिय कश्मीर+ [KCa] चैनल) और एक अनिर्धारित तंत्र है कि piezo चैनल शामिल है के माध्यम से कतरनी प्रेरित वाहिकासंकीर्णन. जैवभौतिक तंत्र को समझना जिसके द्वारा इन चैनलों कतरनी बलों द्वारा सक्रिय कर रहे हैं (यानी, सीधे या एक प्राथमिक mechano-रिसेप्टर के माध्यम से) संभावित नए लक्ष्य प्रदान करने के लिए endothelial रोग के साथ जुड़े pathophysiology को हल कर सकता है और अतींद्रजनन। यह अभी भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग कर वास्तविक समय में आयन चैनलों के प्रवाह प्रेरित सक्रियण रिकॉर्ड करने के लिए एक बड़ी चुनौती है। अच्छी तरह से परिभाषित कतरनी तनाव के लिए कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए मानक तरीके, इस तरह के शंकु और प्लेट rheometer और बंद समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष आयन चैनल सक्रियण के वास्तविक समय अध्ययन की अनुमति नहीं है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक संशोधित समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष है कि अच्छी तरह से परिभाषित कतरनी तनाव के तहत mechanosensitive आयन चैनलों की वास्तविक समय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है का वर्णन करने के लिए है.
Introduction
रक्त प्रवाह से उत्पन्न हीमोडायनामिक बल एंडोथेलियल और संवहनी फलन1,2में प्रमुख भूमिका निभाने के लिए जाने जाते हैं . यह भी अच्छी तरह से जाना जाता है कि आयन चैनलों के कई प्रकार तीव्रता कतरनी तनाव में परिवर्तन का जवाब3,4,5 परिकल्पना है कि आयन चैनल ों प्राथमिक कतरनी तनाव सेंसर हो सकता है के लिए अग्रणी. हाल ही में, हम और अन्य लोगों से पता चला है कि mechanosensitive आयन चैनलकई कतरनी तनाव के लिए vasoactive प्रतिक्रिया सहित कई कतरनी तनाव संवेदनशील संवहनी कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभातेहैं 6,7,8 , और विकासात्मक एंजियोजेनेसिस9. आयन चैनलों के कतरनी तनाव संवेदनशीलता के तंत्र, तथापि, लगभग पूरी तरह से अज्ञात हैं. ज्ञान का यह अंतर सुपरिभाषित कतरनी तनाव के तहत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग करने की तकनीकी कठिनाई के कारण होने की संभावना है। इस लेख में, इसलिए, हम इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया विस्तृत प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम प्रदान करते हैं6,7,10,11.
इस विधि के समग्र लक्ष्य शारीरिक रेंज में अच्छी तरह से परिभाषित कतरनी तनाव के तहत आयन चैनल mechanoactivation की वास्तविक समय जांच की अनुमति है. यह एक मानक समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष को संशोधित करने के द्वारा हासिल की है एक electrophysiological pippette कक्ष में कम किया जा करने के लिए अनुमति देने के लिए और प्रवाह के लिए वास्तविक समय जोखिम के दौरान नीचे की थाली पर हो कोशिकाओं का उपयोग, इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए एक अद्वितीय दृष्टिकोण प्रदान लक्ष्य6,7,11. इसके विपरीत, मानक समानांतर प्लेट प्रवाह कक्षों, पूर्व प्रकाशनों में वर्णित कतरनी बलों को उजागर कोशिकाओं की वास्तविक समय इमेजिंग विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता12 या अन्य गैर इनवेसिव दृष्टिकोण13,14 लेकिन के लिए नहीं वैद्युत शरीर विज्ञान। इसी प्रकार, शंकु और प्लेट उपकरण, कोशिकाओं को अपस्मार करने के लिए एक और शक्तिशाली दृष्टिकोण तनाव15,16 भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त नहीं है। इस प्रकार, इन प्रवाह उपकरणों आयन चैनलों की कतरनी तनाव संवेदनशीलता की जांच की अनुमति नहीं है. प्रवाह के तहत electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रदर्शन में कठिनाई इन महत्वपूर्ण प्रभाव के लिए जिम्मेदार तंत्र के बारे में जानकारी की कमी के लिए मुख्य कारण है.
वैकल्पिक दृष्टिकोण के संदर्भ में एक ही लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, वहाँ कोई नहीं है कि के रूप में सही या नियंत्रित कर रहे हैं. कुछ पहले के अध्ययनों में 17,18से ऊपर के सेल के आस – पासके क्षेत्र में लाए गए अन्य पिपेट से आने वाले तरल की धारा को कोशिकाओं को उजागर करके आयन चैनल गतिविधि को प्रवाह के अधीन रिकॉर्ड करने का प्रयास किया गया . यह अत्यधिक गैर-भौतिक है, क्योंकि इन स्थितियों में उत्पन्न यांत्रिक बलों में रक्त वाहिकाओं में कतरनी तनाव की शारीरिक प्रोफाइल के साथ कम है। इसी तरह की चिंताओं को खुले कक्षों के भ्रम द्वारा शारीरिक कतरनी तनाव अनुकरण करने के प्रयास करने के लिए लागू होते हैं. जैसा कि हमारे पहले के अध्ययन में विस्तार से चर्चा10, एक खुला तरल हवा इंटरफ़ेस कई गड़बड़ी और recirculation, जो गैर भौतिक हैं बनाता है. इन सभी चिंताओं को संबोधित करने के लिए, हम एक संशोधित समानांतर प्लेट (एमपीपी) प्रवाह कक्ष तैयार किया है, यह भी हमारे पहले के अध्ययन में “न्यूनतम इनवेसिव प्रवाह डिवाइस” के रूप में संदर्भित6,7,10,11, बनाया एक्रिलिक से और बड़े पैमाने पर हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया. हालांकि, इस तथ्य के बावजूद कि डिजाइन का मूल विवरण लगभग 20 साल पहले प्रकाशित किया गया है और केवल प्रवाह उपकरण है जो अच्छी तरह से परिभाषित कतरनी तनाव के तहत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने की अनुमति देता है, इस पद्धति को नहीं किया गया है अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाया और वहाँ केवल बहुत कुछ अध्ययन है कि प्रवाह के तहत धाराओं रिकॉर्ड करने का प्रयास कर रहे हैं. इसलिए, हम मानते हैं, कि एमपीपी प्रवाह कक्ष का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करने के लिए जो mechanosensitive आयन चैनलों और संवहनी जीव विज्ञान में रुचि रखते हैं शोध करने के लिए बहुत मदद की होगी.
Protocol
Representative Results
Discussion
संवहनी प्रणाली लगातार सक्रिय हीमोडायनामिक बलों के संपर्क में है, जो मशीन संवेदी आयन चैनलोंकोसक्रिय3 ,22 लेकिन कतरनी तनाव प्रेरित mechanotransduction में इन चैनलों की शारीरिक भूमिकाओं ही है <sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय दिल, फेफड़े, और रक्त संस्थान (R01 HL073965, आईएल) और (T32 HL007829-24, ISF) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. लेखकों को भी हमारे नवीनतम एमपीपी प्रवाह कक्षों पैदा करने के लिए शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय में वैज्ञानिक मशीन की दुकान स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
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