Elektrofysiologische opnames van eencellige ionen stromen onder welomschreven afschuif spanning
Summary
Het doel van dit protocol is om een gemodificeerde parallelle plaat stroom kamer te beschrijven voor gebruik bij het onderzoeken van real-time activering van mechanosensitieve ionenkanalen door shear stress.
Abstract
Vloeibare shear stress is bekend om een belangrijke rol in de endotheliale functie te spelen. In de meeste vasculaire bedden, verhoogde shear stress van acute stijgingen van de bloedtoevoer activeert een signalering Cascade resulterend in vasodilatatie daardoor verlichten mechanische belasting op de vaatwand. Het patroon van shear stress is ook bekend als een kritische factor in de ontwikkeling van atherosclerose met laminaire shear stress wordt atheroprotective en verstoorde shear stress Pro-atherogenic. Terwijl we een gedetailleerd begrip van de verschillende tussenliggende cel signalering trajecten, de receptoren die eerst de mechanische stimulans vertalen in chemische bemiddel kers zijn niet volledig begrepen. Mechanosensitive ionenkanalen zijn van cruciaal belang voor de respons op afschuiving en regelen shear-geïnduceerde cel signalering waardoor de productie van vasoactieve mediatoren. Deze kanalen behoren tot de vroegste geactiveerde signalering componenten te scheren en zijn gekoppeld aan shear-geïnduceerde vasodilatatie door het bevorderen van stikstofmonoxide productie (bv, naar binnen rectificeren K+ [Kir] en voorbijgaande receptor potentieel [TRP] kanalen) en endotheel hyperpolarisatie factor (bijv. Kir en calcium-geactiveerde K+ [KCA] kanalen) en door afschuiving veroorzaakte vasoconstrictie door een onbepaald mechanisme dat piëzo-kanalen omvat. Het begrijpen van het biopfysische mechanisme waarmee deze kanalen worden geactiveerd door afschuifkrachten (d.w.z. direct of via een primaire mechano-receptor) kan potentiële nieuwe doelen bieden om de pathofysiologie te verhelpen die gepaard gaat met endotheliale disfunctie en atherogenese. Het is nog steeds een grote uitdaging om doorstroming geïnduceerde activering van ionenkanalen in real-time te registreren met behulp van elektrofysiologie. De standaardmethoden om cellen bloot te stellen aan goed gedefinieerde shear stress, zoals de kegel-en plaat rheometer en de gesloten parallelle plaat stroom kamer staan geen real-time studie toe van de activering van ionenkanalen. Het doel van dit protocol is om een gemodificeerde parallelle plaat stroom kamer te beschrijven die real-time elektrofysiologische opname van mechanosensitieve ionenkanalen onder welomschreven shear stress mogelijk maakt.
Introduction
Hemodynamische krachten gegenereerd door de bloedstroom zijn bekend om te spelen belangrijke rollen in endotheel en vasculaire functie1,2. Het is ook bekend dat verschillende soorten ionenkanalen acuut reageren op veranderingen in shear stress3,4,5 wat leidt tot de hypothese dat ionenkanalen primaire shear stress sensoren kunnen zijn. Meer recentelijk toonden wij en anderen aan dat mechanogevoelige ionenkanalen kritische rollen spelen in verschillende afschuiving gevoelige vasculaire functies, waaronder de vasoactieve respons op shear stress6,7,8 en ontwikkelings-angiogenese9. De mechanismen van de shear-stress gevoeligheid van ionenkanalen zijn echter bijna volledig onbekend. Deze kloof van kennis is waarschijnlijk te wijten aan de technische moeilijkheid van het uitvoeren van elektrofysiologische opnames onder goed gedefinieerde shear stress. In dit artikel bieden we daarom een stap voor stap gedetailleerd protocol dat routinematig wordt uitgevoerd in ons lab om dit doel te bereiken6,7,10,11.
Het algemene doel van deze methode is om het real-time onderzoek van Ion Channel mechanoactivation onder goed gedefinieerde shear stress in het fysiologische bereik mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door een standaard parallelle plaat stroom kamer te wijzigen, zodat een elektrofysiologische pipet in de kamer kan worden verlaagd en toegang wordt verkregen tot cellen die op de bodemplaat zijn geteeld tijdens de real-time blootstelling aan stroming, wat een unieke aanpak biedt om dit te bereiken doel6,7,11. Standaard parallelle plaat stroomkamers, beschreven in voorgaande publicaties, kunnen worden gebruikt voor de real-time beeldvormings analyse van cellen die zijn blootgesteld aan afschuifkrachten12 of andere niet-invasieve benaderingen13,14 maar niet voor Elektrofysiologie. Evenzo is de kegel-en plaat apparatuur, een andere krachtige benadering om cellen bloot te stellen aan shear stress15,16 ook niet geschikt voor elektrofysiologische opnames. Dus, deze stroom apparaten niet toestaan dat het onderzoek van shear stress gevoeligheid van ionenkanalen. De moeilijkheid bij het uitvoeren van elektrofysiologische opnames onder stroom is de belangrijkste reden voor de schaarste van informatie over de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze cruciale effecten.
In termen van de alternatieve benaderingen om hetzelfde doel te bereiken, zijn er geen die zo nauwkeurig of gecontroleerd zijn. Sommige eerdere studies probeerden de activiteit van het ion-kanaal onder stroom op te nemen door cellen bloot te stellen aan een stroom vloeistof afkomstig van een andere pipet die in de nabijheid van een cel van boven de17,18werd gebracht. Dit is zeer niet-fysiologische, als de mechanische krachten gegenereerd onder deze omstandigheden hebben weinig gemeen met de fysiologische profielen van shear stress in de bloedvaten. Vergelijkbare bezorgdheid is van toepassing op de pogingen om fysiologische afschuif stress te simuleren door een perfusie van open kamers. Zoals uitvoerig besproken in onze eerdere studie10, creëert een open Liquid-Air-interface meerdere storingen en recirculatie, die niet-fysiologisch zijn. Om al deze zorgen aan te pakken, hebben we een gemodificeerde parallelle plaat (MPP)-stroom kamer ontworpen, ook wel de “minimaal invasieve stroomvoorziening” genoemd in onze eerdere studies6,7,10,11, gemaakt van acryl en uitgebreid gebruikt in ons lab. Ondanks het feit dat de oorspronkelijke beschrijving van het ontwerp bijna twintig jaar geleden is gepubliceerd en het enige stroom apparaat is dat het mogelijk maakt elektrofysiologische opnames onder welomschreven afschuif spanning uit te voeren, is deze methodologie echter niet goedgekeurd door andere laboratoria en er zijn slechts zeer weinig studies die proberen om stromen onder stroom op te nemen. Wij zijn daarom van mening dat het verstrekken van een gedetailleerde beschrijving voor het gebruik van de MPP flow Chamber een grote hulp zal zijn voor onderzoeken die geïnteresseerd zijn in mechanosensitieve ionenkanalen en vasculaire biologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het vasculaire systeem wordt voortdurend blootgesteld aan actieve hemodynamische krachten, die mechanosensitieve ionkanalen3,22 activeren, maar de fysiologische rollen van deze kanalen in shear stress-geïnduceerde mechanotransductie is alleen beginnen te ontstaan4,6,8. De mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de mechanosensitiviteit van shear stress-geactiveerde ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door het National Heart, Lung en Blood Institute (R01 HL073965, IL) en (T32 HL007829-24, ISF). De auteurs willen ook de wetenschappelijke machine winkel van de Universiteit van Illinois in Chicago erkennen voor het genereren van onze nieuwste MPP flow Chambers.
Materials
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?. Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of ‘Shear Rings’: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
