蛍光マクロスコピーを用いた無傷マウス頭蓋骨を介した脳脊髄液輸送の生体内イメージング

脳脊髄液(CSF)は、脳と脊髄を浴び、恒常性の維持、栄養素の供給、頭蓋内圧^の調節に関与しています。くも膜下のCSFは皮質動脈を取り囲む周血管空間(PVS)のネットワークを介して脳に入り、その後、貫通動脈2に沿って流れ落ちる。一度、CSFは間質液(ISF)と交換し、アミロイドβ(Aβ)やタウタンパク質などの有害な代謝産物を脳外に運び、低抵抗性の白質路および経度空間2、3を通して凝集体する。.この経路は、アストログリアアクアポリン-4(AQP4)チャネルに依存し、したがってグリアリンパ系(リンパ系)^系4と呼ばれた。神経ピルの廃棄物は、最終的に頭蓋骨神経の近くのリンパ管を介してCSF-ISFから、頸部リンパ節^に向かって髄膜に取り除かされる5。このシステムの障害は、アルツハイマー病6、7、外傷性脳損傷3、虚血性および出血性脳卒中8などのいくつかの神経疾患に関与している。

CSF輸送は、過去にシスターナマグナ(CM)9、10^およびリンパ研究にトレーサーを注入することによって可視化することができ、主に2光子顕微鏡検査4、11、12^を利用している。 ¹³, 磁気共鳴イメージング (MRI)^14,15,16,17, および ex vivo イメージング^3,6,^11,18トレーサーの動態を評価する。2光子顕微鏡は、PVSおよび高い空間分解能によるCSFトレーサーの詳細なイメージングに適した方法ですが、視野が狭く、侵襲的な頭蓋窓や頭蓋骨の薄化が必要です。Ex vivoイメージングは、免疫組織化学と組み合わせることで、単一細胞から脳全体に至るまでのマルチレベル分析^{を可能にする19.}しかしながら、死後組織を観察するために必要な灌流固定のプロセスは、CSF流向に大きな変化を生じ、PVSを崩壊させ、ト^{レーサー12}の分布および位置を著しく変化させる。最後に、MRIはマウスと人間の脳全体のCSF流れを追跡できますが、血管周囲流の空間的および時間的分解能を欠いている。

新しい技術である経頭蓋マクロ画像は、生きているマウスの後頭皮質全体における血管CSF輸送の広視野イメージングを可能にすることによって、これらの限界のいくつかを解決する。このタイプのイメージングは、マルチバンドフィルタキューブ、微細LED光源、および高効率CMOS^カメラ10を使用してエピ蛍光マクロスコープで行われます。これらのセットアップは、頭蓋骨表面の下1〜2ミリメートルまでのPVSを解決することができ、頭蓋骨を完全に無傷^の10のままにしながら、皮質表面の下に5〜6ミリメートルまでの蛍煙を検出することができます。励起波長を素早く調整できるマルチバンドフィルタとLEDにより、複数の蛍光色素を使用することで、CSFは同じ実験で異なる分子量と化学的特性のトレーサーで標識することができます。

この手順では、頭蓋骨を露出させ、イメージングセッション中に頭部を安定させるために軽量ヘッドプレートを配置する簡単で最小限に侵襲的な手術が必要です。トレーサーは、頭蓋骨に穴をあけたり、ピペットまたはカニューレ9、20で皮質組織を貫通することなく、CMに送達することができます。CMカニューレとヘッドプレートの両方が数日間安定したままで、古典的なエンドポイントビジュアライゼーションと比較して、より複雑な実験設計を容易にします。このプロトコルは、麻酔/睡眠または覚醒マウスのCMに蛍光CSFトレーサーの急性または慢性注射後のリンパ系機能を研究するために経頭蓋マクロスコピックイメージングを使用する方法を説明する。