في التصوير في الجسم من نقل السائل الدماغي الشوكي من خلال جمجمة الماوس سليمة باستخدام التنظير الكلي الفلوري
Summary
يسمح التصوير البصري عبر الجمجمة بالتصوير الواسع النطاق لنقل السوائل الدماغية الشوكية في قشرة الفئران الحية من خلال جمجمة سليمة.
Abstract
وقد تم دراسة تدفق السائل الدماغي الشوكي (CSF) في القوارض إلى حد كبير باستخدام القياس الكمي الجسم يُذكر. وقد مكنت تقنيات مثل التصوير المجهري باثنين من الفوتون اتّصال بالرنين المغناطيسي (MRI) في التحديد الكمي للسير في الجسم الحي لتدفق الـ CSF، ولكنها محدودة بانخفاض أحجام التصوير وانخفاض الاستبانة المكانية، على التوالي. وقد وجدت الأعمال الأخيرة أن CSF يدخل parenchyma الدماغ من خلال شبكة من المساحات المحيطة بالأوعية الدموية المحيطة الشرايين pial واختراق قشرة القوارض. هذا الدخول في الأوعية الدموية من CSF هو المحرك الرئيسي للنظام اللمفي، وهو مسار متورط في إزالة solutes الأيضية السامة (على سبيل المثال، الأميلويد بيتا). هنا، نقوم بتوضيح تقنية التصوير العيانية الجديدة التي تسمح في الوقت الحقيقي، والتصوير التنظيري من تتبع CSF الفلورسنت من خلال الجمجمة سليمة من الفئران الحية. هذه الطريقة طفيفة التوغل تسهل العديد من التصاميم التجريبية وتمكن من اختبار واحد أو متكرر لديناميات CSF. تحتوي النطاقات الكبيرة على دقة مكانية وزمنية عالية، كما تسمح العملاقة الكبيرة ومسافة العمل بالتصوير أثناء أداء المهام على الأجهزة السلوكية. وقد تم التحقق من صحة هذا النهج التصوير باستخدام التصوير بالفوتونوتين وقياسات الفلورة التي تم الحصول عليها من هذه التقنية ترتبط ارتباطا ً قوياً بالفلورة في الجسم الحي السابق والتحديد الكمي للتتبعات التي تحمل علامة راديوية. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف كيف يمكن استخدام التصوير العياني عبر الجمجمة لتقييم النقل اللمفي في الفئران الحية، مما يوفر بديلاً يسهل الوصول إليه لطرائق التصوير الأكثر تكلفة.
Introduction
السائل الدماغي الشوكي (CSF) يستحم الدماغ والحبل الشوكي ويشارك في الحفاظ على التوازن، وتوفير المواد الغذائية،وتنظيم الضغط داخل الجمجمة 1. يدخل CSF في الفضاء تحت العنكبوتية الدماغ من خلال شبكة من المساحات المحيطة بالأوعية الدموية (PVS) المحيطة الشرايين القشرية ثم يتدفق على طول اختراق arterioles2. مرة واحدة في parenchyma، وCSF التبادلات مع السائل الخلالي (ISF)، تحمل الأيض الضارة مثل الأميلويد بيتا (Aβ) والبروتين تاو المجاميع من الدماغ من خلال انخفاض مقاومة المسالك المادة البيضاء والمساحات perivenous2،3 . يعتمد هذا المسار على قنوات aquaporin-4 (AQP4) الفلكية، وبالتالي أطلق عليه نظام اللمفية الغلية (اللمفوتيك)4. يتم في نهاية المطاف تطهير النفايات من neuropil من CSF-ISF من خلال الأوعية اللمفاوية بالقربمن الأعصاب القحفية وفي السحايا نحو العقد الليمفاوية عنق الرحم 5. وقد تورط فشل هذا النظام في العديد من الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر6،7، وإصابات الدماغ الصادمة3، والسكتة الدماغية الإقفارية والنزفية8.
يمكن تصور نقل CSF عن طريق غرس التتبع في التريج (CM)9و10 والدراسات اللمفية في الماضي استخدمت أساسا اثنين من الفوتون المجهري4،11،12، 13، التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)14،15،16،17، وتصوير الجسم الحي السابق3،6،11، 18 لتقييم حركية التتبع. اثنين من الفوتون المجهري هو وسيلة مناسبة للتصوير المفصل للتتبع CSF في PVSs وparenchyma بسبب الدقة المكانية العالية، ومع ذلك، لديها مجال ضيق من الرؤية ويتطلب نافذة الجمجمة الغازية أو ترقق الجمجمة. التصوير الجسم الحي السابق، جنبا إلى جنب مع الكيمياء المناعية، تمكن من تحليلات متعددة المستويات تتراوح بين خلايا واحدة تصل إلى الدماغ كله19. ومع ذلك، فإن عملية تثبيت التسريب المطلوبة لمراقبة أنسجة ما بعد الوفاة تنتج تغييرات عميقة في اتجاه تدفق CSF وينهار PVS، مما يغير بشكل كبير توزيع وموقع التتبع12. وأخيرا، في حين أن التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن تتبع تدفق CSF في جميع أنحاء المورين كامل والدماغ البشري، فإنه يفتقر إلى الدقة المكانية والزمنية للتدفق حول الأوعية الدموية.
تقنية جديدة، التصوير العياني عبر الجمجمة، يحل بعض هذه القيود عن طريق تمكين التصوير واسعة المجال من نقل CSF حول الأوعية الدموية في القشرة الظهرية بأكملها من الفئران الحية. ويتم هذا النوع من التصوير مع ماكروسكوب epifluorescent باستخدام مكعب فلتر متعدد النطاقات، ومصدر ضوء LED قابل للضبط، وكاميرا CMOS عالية الكفاءة10. هذه الماكياج قادرة على حل PVSs تصل إلى 1-2 ملم تحت سطح الجمجمة، ويمكن الكشف عن الفلوروفوريصلات تصل إلى 5-6 ملم تحت سطح القشرية مع ترك الجمجمة سليمة تماما10. المرشحات متعددة النطاقات والمصابيح التي يمكن أن تصليق بسرعة الطول الموجي الإثارة تمكين استخدام الفلوروفورمتعددة مما يسمح CSF أن توصف مع التتبع من مختلف الأوزان الجزيئية والخصائص الكيميائية في نفس التجربة.
يتطلب هذا الإجراء إجراء جراحة بسيطة وطفيفة التوغل لفضح الجمجمة ووضع لوحة رأس خفيفة الوزن لتثبيت الرأس أثناء جلسة التصوير. يمكن تسليم التتبع اتّصال إلى CM دون حفر في الجمجمة أواختراق الأنسجة القشرية مع الماصات أو القنانية 9،20. كل من قنية CM ولوحات الرأس تبقى مستقرة لعدة أيام إلى أسابيع وتسهيل التصاميم التجريبية أكثر تعقيدا بالمقارنة مع التصور نقطة النهاية الكلاسيكية. يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام التصوير العياني عبر الجمجمة لدراسة وظيفة النظام اللمفاوي بعد الحقن الحاد أو المزمن لمتتبع CSF الفلورسنت في سم الفئران مخدر / النوم أو مستيقظا.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد وصفنا بروتوكول مفصل لأداء التصوير عبر الجمجمة CSF في الفئران الحية باستخدام منظار الماكروالفلورسنت المتاحة تجاريا والتتبع. هذه التقنية بسيطة وطفيفة التوغل، ولكن كمية. في التصوير الحي يرتبط بشكل جيد مع الأساليب الحساسة مثل السائل اللمعة العد من التتبع اتلاف وصفت لاسلكيا بما في ذلك 3<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية والمعهد الوطني للشيخوخة (المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة؛ R01NS100366 و RF1AG057575 to MN)، وبرنامج مؤسسة ليدوك لشبكات التميز عبر المحيط الأطلسي، وبرنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020 (المنحة رقم 666881؛ SVDs@target). ونود أيضا أن نشكر دان شوي على مساعدة الخبراء في الرسوم التوضيحية.
Materials
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane – Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 – Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
References
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers – anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
- Da Mesquita, ., S, , et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
- Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
- Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
- Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ren, Z., et al. Hit & Run’ model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
- Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
- Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).
