Análisis experimental del engulfment de thymocyte Apopético por los macrófagos
Summary
Aquí presentamos un protocolo para preparar los timocitos apopónticos y los macrófagos peritoneal y analizar la eficiencia de la efervocitosis y el bloqueo específico por inhibidores de los timocitos apopónticos. Este protocolo tiene una amplia aplicación en el aclaramiento mediado por células de otras partículas, incluyendo granos artificiales y bacterias.
Abstract
La apoptosis celular es un proceso natural y desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario, la regulación homeostática, la inducción de la tolerancia inmune y la resolución de la inflamación. La acumulación de desechos apopónticos en el cuerpo puede desencadenar respuestas inflamatorias crónicas que conducen a enfermedades autoinmunes sistémicas con el tiempo. El aclaramiento de células apopónticas deterioradas se ha implicado en una variedad de enfermedades autoinmunes. El aclaramiento apopético es un proceso complejo que raramente se detecta en condiciones fisiológicas. Implica abundantes receptores de superficie y moléculas de señalización. El estudio del proceso de aclaramiento de la célula apopéctica proporciona mecanismos moleculares perspicaces y subsiguientes respuestas biológicas, que pueden conducir al desarrollo de nuevas terapias. Aquí describimos los protocolos para la inducción de los timocitos apopónticos, la preparación de los macrófagos peritoneales y el análisis del aclaramiento de las células apopónticas por citometría de flujo y microscopía. Todas las células se someten a la apoptosis en una cierta etapa, y muchas células residenciales y circulantes pueden captación de desechos apopético. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí se puede utilizar en muchas aplicaciones para caracterizar la Unión de la célula apopóntica y la ingestión por muchos otros tipos de células.
Introduction
Nuestro cuerpo genera 1-10 mil millones de células apopónticas sobre una base diaria. Se debe borrar un número tan grande de células apopónticas de manera que las respuestas inmunitarias permanezcan en reposo. Para asegurar el aclaramiento de las células apopónticas de manera oportuna, numerosos tipos de células residentes de tejido y células circulantes desarrollan mecanismos para engullir las células apopónticas1. Regulación disfuncional de la apoptosis se ha implicado en la aparición y progresión de diversas enfermedades inflamatorias y autoinmunidad2. La apoptosis también desempeña un papel crítico en la patogénesis del desarrollo del cáncer y su posterior resistencia a los tratamientos convencionales3,4. La eliminación de las células apopónticas generalmente promueve una respuesta antiinflamatoria, que puede estar relacionada con la tolerancia inmunológica5. La alteración del aclaramiento de las células apopónticas impulsa la autoinmunización y contribuye al desarrollo de enfermedades autoinmunes sistémicas tanto en humanos como en ratones6.
Cuando las células se someten a la apoptosis, exponen la fosfatidilserina (PtdSer) desde el prospecto interno hasta el prospecto externo de la membrana. El PtdSer será reconocido por los fagocitos a través de los receptores de la superficie. Se han identificado más de una docena de receptores para reconocer y/o facilitar el internalización de las células apopónticas. En general, hay al menos tres tipos de receptores de superficie implicados en el aclaramiento de la célula apopóntica: receptores tethering, reconocer las células apopónticas; receptores de cosquillas, iniciar el engulfment; receptores de Chaperos, facilitan todo el proceso7. Los receptores de tirosina quinasas TAM (TAM RTKs) constan de Tyro-3, AXL y MER y se expresan principalmente por células mieloide del sistema inmunitario8. La función principal de TAM RTKs es servir como receptores de tethering, facilitando la eliminación fagocitaria de células apopónticas y escombros. Nuestro grupo ha estudiado el aclaramiento de células apopécticas mediadas en el entorno de autoinmunidad durante muchos años. El crecimiento proteico dependiente de la vitamina K, proteína específica 6 (Gas6) y proteína S (pros) se une y activa los receptores TAM9,10. Gas6 se produce en el corazón, los riñones y los pulmones. ProS se produce principalmente en el hígado11. TAM reconoce las células apopónticas de tal manera que la terminal N de Gas6/ProS se une al PtdSer en una célula apopéctica y el terminal C de Gas6/ProS se une a los receptores TAM que anclaron en la superficie de los fagocitos. Junto con los otros receptores, el internalización de las células apopónticas se produce12. Aunque Mer puede unirse a los ligandos ProS y Gas6, descubrimos que Gas6 parece ser el ligando único para la fagocitosis de macrófagos mediada por Mer de las células apopónticas, que pueden ser bloqueadas por el anticuerpo anti-Mer13. Los macrófagos son fagocitos profesionales. El aclaramiento rápido de las células apopónticas por macrófagos es importante para la inhibición de la inflamación y las respuestas autoinmunes contra antígenos intracelulares. El receptor de la tirosina quinasa del Mer es crítico para el internalización del macrófago y el aclaramiento eficiente de las células apopónticas14. En el bazo del ratón, Mer expresa principalmente en la zona marginal y los macrófagos corporales tangibles13.
El protocolo presentado aquí describe un método básico para inducir la apoptosis celular y demostrar maneras de medir el proceso y la eficiencia de la efervocitosis. Estos protocolos pueden ser fácilmente adaptados para estudiar la efferocitosis por otros tipos de células en el internalización de las células apopónticas de diferentes orígenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La apoptosis es un proceso de muerte celular altamente conservado que involucra muchas cascadas de señal e induce la expresión de proteínas, secreción, y el transporte. La apoptosis se asocia a menudo con los cambios de morfología celular17. Las células apopónticas liberan activamente citocinas y quimioquinas que atraen a los fagocitos para emigrar al sitio e iniciar el proceso de engulfment, una vía extremadamente compleja bajo control estricto18. Por otro lado, la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación en el laboratorio de Shao es apoyada por la investigación de premio innovador de la Facultad de medicina y el Premio de piloto de la Facultad Junior del Departamento de medicina interna, Universidad de Cincinnati y Grant DK K01_095067 de NIDDK/NIH.
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
References
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