Experimentelle Analyse des Apoptotic Thymozyte Engulfment durch Macrophagen
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung von apoptotischen Thymozyten und peritonealen Makrophagen vor und analysieren die Effizienz der Eskrozytose und die spezifische hemmungsvermittelte Blockierung apoptotischer Thymozyten-Verengungen. Dieses Protokoll hat eine breite Anwendung in der zellvermittelten Räumung anderer Partikel, einschließlich künstlicher Perlen und Bakterien.
Abstract
Die Zellapoptose ist ein natürlicher Prozess und spielt eine entscheidende Rolle bei der embryonalen Entwicklung, der homöostatischen Regulierung, der Immuntoleranzinduktion und der Auflösung von Entzündungen. Die Ansammlung von apoptotischen Schutt im Körper kann chronisch entzündliche Reaktionen auslösen, die im Laufe der Zeit zu systemischen Autoimmunerkrankungen führen. Die gestörte Apoptotikzellfreiheit wurde in eine Vielzahl von Autoimmunerkrankungen verwickelt. Die Apoptotikabstände sind ein komplexer Prozess, der selten unter physiologischen Bedingungen entdeckt wird. Es handelt sich um reichlich Oberflächenrezeptoren und Signalmoleküle. Die Untersuchung des Prozesses der apoptotischen Zellfreiheit bietet aufschlussreiche molekulare Mechanismen und anschließende biologische Reaktionen, die zur Entwicklung neuer Therapeutika führen können. Hier beschreiben wir Protokolle zur Induktion von apoptotischen Thymozyten, zur Herstellung von peritonealen Makrophagen und zur Analyse der apoptotischen Zellfreiheit durch Strömungszytometrie und Mikroskopie. Alle Zellen werden sich in einem bestimmten Stadium einer Apoptose unterziehen, und viele Wohn-und Umlaufzellen können apoptotische Trümmer aufnehmen. Daher kann das hier beschriebene Protokoll in vielen Anwendungen verwendet werden, um die apoptotische Zellbindung und-einnahme durch viele andere Zelltypen zu charakterisieren.
Introduction
Unser Körper erzeugt 1-10 Milliarden apoptotische Zellen täglich. Eine so große Anzahl apoptotischer Zellen muss so geklärt werden, dass die Immunreaktionen ruhig bleiben. Um die rechtzeitige Freigabe von apoptotischen Zellen zu gewährleisten, entwickeln zahlreiche Arten von Gewebezellen und zirkulierenden Zellen Mechanismen, um apoptotische Zellenzu verschlingen. Die Dysfunktionale Regulierung der Apoptose wurde in den Beginn und das Fortschreiten verschiedener entzündlicher Erkrankungen und der Autoimmunität2 in den Körper verwickelt. Die Apoptose spielt auch eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Krebsentwicklung und ihrer anschließenden Resistenz gegen konventionelle Behandlungen3,4. Das Entfernen von apoptotischen Zellen fördert in der Regel eine entzündungshemmende Reaktion, die mit der immunologischen Toleranz in Verbindung gebracht werden kann 5. Die Störung der apoptotischen Zellfreiheit treibt die Selbstironie voran und trägt zur Entwicklung systemischer Autoimmunerkrankungen sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen bei.
Wenn sich die Zellen einer Apoptose unterziehen, setzen sie das Phosphatidylserin (PtdSer) vom inneren Flugblatt zum äußeren Merkblatt der Membran aus. PtdSer wird dann durch Oberflächenrezeptoren durch Phagozyten erkannt. Mehr als ein Dutzend Rezeptoren wurden identifiziert, um die Verengung von apoptotischen Zellen zu erkennen und zu erleichtern. In der Regel sind mindestens drei Arten von Oberflächenrezeptoren in den apoptotischen Zellabstand involviert: Tethering-Rezeptoren, Apoptotikzellen erkennen; Tickling-Rezeptoren, Auflösung auslösen; Begleitrezeptoren, erleichtern den gesamtenProzess 7. TAM-Rezeptor-Tyrosinkinasen (TAM RTKs) bestehen aus T yro-3, Axl und M er und werdenvor allem durch myeloide Zellen des Immunsystems8 ausgedrückt. Die primäre Funktion von TAM RTKs ist es, als innimmende Rezeptoren zu dienen, was die phagozytische Entfernung von apoptotischen Zellen und Schutt erleichtert. Unsere Fraktion hat seit vielen Jahren die Behandlung von TAM vermittelter apoptotischer Zellfreiheit im Rahmen der Autoimmunität untersucht. Das Vitamin K-abhängige Proteinwachstum verhaftet spezifisches Protein 6 (Gas6) und Protein S (ProS) bindetundaktiviert TAM-Rezeptoren 9,10. Gas6 wird im Herzen, in den Nieren und in der Lunge produziert. ProS wird hauptsächlich in der Leber 11produziert. TAM erkennt die apoptotischen Zellen so, dass das N-Terminal von Gas6/ProS auf einer apoptotischen Zelle an den PtdSer bindet und das C-Terminal von Gas6/ProS an TAM-Rezeptoren bindet, die auf der Oberfläche von Phagozyten verankert sind. Zusammen mit den anderen Rezeptoren erfolgt die Verengung der apoptotischen Zellen 12. Obwohl Mer sowohl an die Liganden ProS als auch Gas6 binden kann, haben wir festgestellt, dass Gas6 der einzige Ligand für die von der Mer-vermittelten Makrophage-Phagozytosederapoptotischen Zellen zu sein scheint, die durch den Anti-Mer-Antikörper 13 blockiert werden kann. Makrophagen sind professionelle Phagozyten. Die schnelle Räumung von apoptotischen Zellen durch Makrophagen ist wichtig für die Hemmung von Entzündungen und Autoimmunreaktionen gegen intrazelluläre Antigene. Die Mer-Rezeptor-Tyrosinkinase ist entscheidend für die Makrophage-Gravur und die effiziente Räumung der apoptotischen Zellen 14. In der Maus-Milz drückt Mer vor allem auf die Randzoneundgreifbare Körpermakrophagen 13.
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine grundlegende Methode, um die Zellapoptose zu induzieren und Wege aufzuzeigen, wie der Prozess und die Effizienz der Eskrozytose gemessen werden können. Diese Protokolle können leicht angepasst werden, um die Eerozytose durch andere Zelltypen in der Verengung von apoptotischen Zellen unterschiedlicher Herkunft zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apoptose ist ein hochkonservierter Zelltod Prozess, der viele Signalkaskaden mit sich bringt und Proteinausdruck, Sekretion und Transport hervorruft. Die Apoptose wird oft mit den Veränderungen der Zellmorphologie 17 in Verbindung gebracht. Apoptotische Zellen setzen aktiv Zytokine und Chemokine frei, die Phagozyten anziehen, um auf die Website zu migrieren und den Prozess der Enge einzuleiten, ein extrem komplexer Pfad unter strenger Kontrolle18. Auf der anderen Seite set…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung im Shao Lab wird unterstützt durch den Research Innovative Award des College of Medicine und den Junior Faculty Pilot Award von der Abteilung für Innere Medizin der Universität Cincinnati und gewähren DK K01_095067 von NIDDK/NIH.
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
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