Inyección de huevos de Gryllus bimaculatus
Summary
Aquí presentamos un protocolo para inyectar huevos de cricket, una técnica que sirve como método fundamental en muchos experimentos en el cricket, incluyendo, pero no limitado a, interferencia de ARN y manipulación genómica.
Abstract
La alteración de la función génica en un organismo en desarrollo es fundamental para diferentes tipos de experimentos. Si bien se han desarrollado herramientas genéticas tremendamente poderosas en los sistemas de modelos tradicionales, es difícil manipular genes o ARN mensajero (ARNm) en la mayoría de los otros organismos. Al mismo tiempo, los enfoques evolutivos y comparativos se basan en una exploración de la función génica en muchas especies diferentes, lo que requiere el desarrollo y la adaptación de técnicas para manipular la expresión fuera actualmente tratable genéticamente Especies. Este protocolo describe un método para inyectar reactivos en huevos de grillo para analizar los efectos de una manipulación dada en el desarrollo embrionario o larvario. Se describen las instrucciones para recoger e inyectar óvulos con agujas biseladas. Esta técnica relativamente sencilla es flexible y potencialmente adaptable a otros insectos. Uno puede reunir e inyectar docenas de óvulos en un solo experimento, y las tasas de supervivencia para las inyecciones sólo de amortiguación mejoran con la práctica y pueden ser tan altas como 80%. Esta técnica apoyará varios tipos de enfoques experimentales, incluida la inyección de agentes farmacológicos, el ARNm tapado in vitro para expresar genes de interés, el ARN de doble cadena (dsRNA) para lograr la interferencia del ARN, el uso de Repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas (CRISPR) en conjunto con reactivos de proteína 9 (Cas9) asociados a CRISPR para modificación genómica y elementos transposables para generar líneas transgénicas transitorias o estables.
Introduction
La capacidad de modificar el genoma o influir en la expresión génica en los organismos es la base para el diseño de muchos tipos de experimentos que prueban la causalidad funcional. También es fundamental para el trabajo comparativo y evolutivo relevante que las técnicas de modificación genómica y no genómica estén disponibles en organismos fuera de los sistemas de modelos animales de laboratorio genético sin importancia (por ejemplo, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, y Caenorhabditis elegans). Ya sea el deseo de entender la diversidad del organismo1 o la adhesión de uno al principio de Krogh, que para cada pregunta biológica hay un organismo más adecuado para su solución 2,3, la capacidad de modificar genomas o la expresión génica es esencial para los diseños experimentales modernos.
El grillo Gryllus bimaculatus es un sistema modelo emergente. Utilizado durante el siglo pasado en experimentos de neuroetología4, las últimas dos décadas han sido testigos de un mayor interés experimental en el cricket, particularmente centrado en la evolución y desarrollo de este organismo5. El grillo es un insecto hemimetabolous que se ramifica basalmente a los insectos holometabolosos bien estudiados, como D. melanogaster y Tribolium castaneum6. Debido a su posición útil sobre el árbol evolutivo, los científicos están interesados en hacer preguntas experimentales modernas y sofisticadas en este insecto, lo que ha llevado a un creciente interés en adaptar las herramientas moleculares para su uso en G. bimaculatus.
Las inyecciones de reactivos moleculares en huevos de grillo se pueden utilizar para experimentos de modificación genómica, así como manipulaciones no genómicas de la expresión génica en embriones. Por ejemplo, se han creado inserciones transgénicas G. bimaculatus que transportan eGFP utilizando la transposase piggyBac7,8. Los investigadores han creado con éxito noqueos G. bimaculatus utilizando nucleasas de zinc-dedo (ZFN) y nucleasas de efector de activador de tipo activador de transcripción (TAL) (TALENs) para introducir roturas de doble cadena en regiones genómicas específicas9. Aunque los ZFN y los TALENs permiten la segmentación específica del sitio en animales más allá de los cuatro grandes sistemas de modelos, estos reactivos han sido rápidamente superados por el sistema CRISPR/Cas9, que es más fácil de usar, más eficiente y altamente flexible10. CRISPR se ha utilizado en G. bimaculatus para producir knock-out11, así como las líneas de knock-in12,13 Además de la modificación genómica, dsRNA se puede inyectar en los huevos para derribar la expresión de ARNm en el desarrollo embriones, permitiendo a los investigadores comprender el papel de las transcripciones específicas a lo largo del desarrollo14,15. Algunos detalles limitados sobre cómo inyectar huevos de grillo se han publicado anteriormente12.
Aquí, describimos un protocolo detallado para inyectar los primeros huevos de G. bimaculatus. Este protocolo es eficaz y fácilmente adaptable a varios entornos de laboratorio, materiales de inyección, y posiblemente a otros insectos. Si bien se han publicado detalles adicionales para diseñar e implementar experimentos de modificación genómica y derribo en otros lugares12,13, estos enfoques se basarán en última instancia en el protocolo de inyección detallado aquí.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los dos principales desafíos con esta técnica son los problemas relacionados con el tamaño óptimo de la aguja y la supervivencia. Aunque las agujas más pequeñas mejoran la supervivencia, las agujas con lúmenes más estrechos tienen un mayor grado de fuerzacapilar en el trabajo, lo que hace que sea más probable que la yema se mueva en la aguja haciendo que se obstruya. En el mejor de los casos, los bloqueos se pueden eliminar simplemente inyectando otro huevo o limpiando la aguja como se describió anteriormente. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación reportada en este proyecto fue apoyada por un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención P20GM10342 a HH3, y por el número de premio NSF IOS-1257217 a Cge.
Materials
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence | |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | ||
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- | |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) | |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | ||
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | ||
| Tubing to connect air source to microinjector | ||||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic | |
| Microwave | various | |||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26°C are needed. | ||
| cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | ||
| cricket wter | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | ||
| cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | ||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament | |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. | |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head | |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90mm diameter | |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand | |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure | |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 – 1.0 mm | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep | |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118mm | |
| syringe filters, 25mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 ml syringe | |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work | |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank | |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, | |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20uL Microloader | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | ||
| 20X objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | ||
| camera | Leica | DMC 5400 | ||
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here | |
References
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