グリルス・ビマキュラトゥス・エッグを注入する
Summary
ここでは、クリケットの卵を注入するプロトコルを提示します, を含むが、これらに限定されないクリケットの多くの実験で基礎的な方法として機能する技術, RNA干渉とゲノム操作.
Abstract
発達中の生物の遺伝子機能を変えることは、さまざまな種類の実験の中心である。従来のモデルシステムでは非常に強力な遺伝子ツールが開発されていますが、他のほとんどの生物では遺伝子やメッセンジャーRNA(mRNA)を操作することは困難です。同時に、進化的および比較的アプローチは、多くの異なる種における遺伝子機能の探索に依存しており、現在遺伝的に扱いやすい外で発現を操作する技術の開発と適応を必要とする。種。このプロトコルは、胚または幼虫の発達に対する所定の操作の影響をアッセイするために、クリケットの卵に試薬を注入する方法について説明する。卵を採取し、ベベラ針で注入する方法について説明する。この比較的簡単な技術は、他の昆虫に柔軟で適応可能です。1回の実験で数十個の卵を集めて注入することができ、バッファーのみの注射の生存率は練習で改善し、80%も高くなる可能性があります。この技術は、薬理学的薬剤の注射、目的の遺伝子を発現するインビトロキャップmRNA、RNA干渉を達成するための二本鎖RNA(dsRNA)、クラスター化を定期的に使用するなど、いくつかのタイプの実験的アプローチをサポートします。CRISPR関連タンパク質9(Cas9)と組み合わせて間隔をあけた短いパリンドロミックリピート(CRISPR)とゲノム修飾のための試薬、および転移可能な要素を使用して、過渡性または安定なトランスジェニックラインを生成します。
Introduction
生物におけるゲノムを改変したり、遺伝子発現に影響を与える能力は、機能的因果関係をテストする多くのタイプの実験の設計の基礎である。また、ゲノムおよび非ゲノム修飾技術が、従来の遺伝的実験動物モデルシステム(例えば、ムスマス、ダニオ)以外の生物で利用できる、比較および進化的に関連する研究にとっても重要である。 レリオ、ショウジョウバエメラノガスター、カエノラブディス症エレガンス)。組織の多様性1を理解する願望であろうと、クローの原理に対する自分の遵守であろうと、すべての生物学的疑問に対して、その解決策2、3、ゲノムを改変する能力に最も適した生物があること、または遺伝子発現に影響を与えるのは、現代の実験計画に不可欠である。
クリケットのグリルス・ビマキュラトゥスは、新しいモデルシステムです。神経学実験4で最後の世紀に使用され、過去20年間は、特にこの生物の進化と発達に焦点を当てたクリケットへの実験的関心の増加を目撃しています5.クリケットは、D.メラノガスターやトリボリウムカスタネウム6などのよく研究されたホロ代謝昆虫に基流域に分岐するヘミメタボラス昆虫です。進化の木に有用な位置のために、科学者は、G.ビマクラトゥスでの使用のための分子ツールを適応させることに関心が高まっているこの昆虫で近代的で洗練された実験的な質問に興味を持っています。
クリケットの卵への分子試薬の注入は、胚における遺伝子発現の非ゲノム操作と同様にゲノム修飾実験に使用することができる。例えば、eGFP挿入物を運ぶトランスジェニックG.ビマクラタスは、トランスポザーゼピギーバク7、8を用いて作成されている。研究者は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)および転写活性化剤(TAL)エフェクターヌクレアーゼ(TALENs)を用いてノックアウトG.バイマキュラトゥスを作成し、特定のゲノム領域9に二本鎖破断を導入することに成功した。ZFNとTALENは、大きな4つのモデルシステムを超えて動物のサイト固有のターゲティングを可能にしますが、これらの試薬は、使いやすく、より効率的で、柔軟性の高い10のCRISPR/Cas9システムによって急速に上回っています。CRISPRはG.バイマクラトゥスでノックアウト11とノックインライン12、13ゲノム修飾に加えて、dsRNAを卵に注入してmRNA発現をノックダウンするために使用されています。胚は、研究者が開発14、15を通じて特定の転写物の役割を理解することを可能にする。クリケットの卵を注入する方法に関するいくつかの限られた詳細は、以前に12が公開されています.
ここでは、早期G.ビマクラトゥス卵を注入するための詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、様々な実験室の設定、注射材料、およびおそらく他の昆虫に効果的かつ容易に適応可能です。ゲノム修飾およびノックダウン実験の設計と実装に関する追加の詳細は、他の場所で12、13に公開されていますが、これらのアプローチは最終的にここで説明する注入プロトコルに依存します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この技術の2つの主な課題は、最適な針のサイズと生存性の関連する問題です。小さい針は生存率を向上させるが、より狭い内気管を持つ針は、作業中の毛細血管力の程度が大きいため、黄身が針に移動して詰まらせる可能性が高くなる。最良の場合、閉塞は、単に別の卵を注入するか、または上記のように針をクリアすることによってクリアすることができます。また、卵黄が針から押し出…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本プロジェクトで報告された研究は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所の機関開発賞(IDeA)の助成番号P20GM10342からHH3、NSF賞番号IOS-1257217の支援を受けました。Cge。
Materials
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence | |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | ||
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- | |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) | |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | ||
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | ||
| Tubing to connect air source to microinjector | ||||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic | |
| Microwave | various | |||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26°C are needed. | ||
| cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | ||
| cricket wter | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | ||
| cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | ||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament | |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. | |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head | |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90mm diameter | |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand | |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure | |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 – 1.0 mm | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep | |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118mm | |
| syringe filters, 25mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 ml syringe | |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work | |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank | |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, | |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20uL Microloader | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | ||
| 20X objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | ||
| camera | Leica | DMC 5400 | ||
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here | |
References
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