ラット表皮と真皮をサーモリジンと分離して、部位特異的炎症性mRNAおよびタンパク質を検出する
Summary
ここで提示される、表皮を真皮から分離し、炎症性メディター産生を評価するためのプロトコルである。炎症に続いて、ラット後足表皮は、4°Cでサーモリシンによって真皮から分離される。 次に、表皮を、ウエスタンブロットおよび免疫染色法によるRT-PCRおよびタンパク質評価によるmRNA解析に使用する。
Abstract
皮膚損傷、炎症、および/または感作中の炎症性メディエーターおよびニューロトロフィンの部位特異的産生を決定するには、使いやすく安価な技術が必要です。本研究の目的は、4°Cで活性であるプロテイナーゼであるサーモリシンを用いた表皮皮膚分離プロトコルを記述することにある。 この手順を説明するために、スプレイグ・ドーリーラットは麻酔を受け、右後足にはカラギーナンを注射する。注射の6時間と12時間後、炎症とナイーブラットを持つラットは安楽死させられ、後足の一部、グラブルーの皮膚は冷たいダルベッコの修正されたイーグル培地に入れられる。表皮は、次いで、塩化カルシウムを用いてPBSでサーリシンによって真皮から基膜で分離される。次に、真皮はマイクロ解剖鉗子によって固定され、表皮は穏やかにからかわれ、組織切片のトルイジンブルー染色は、表皮が地下膜の真皮からきれいに分離されていることを示す。すべてのケラチノサイト細胞層はそのまま残っており、表皮レテの隆起は、真皮乳頭からのくぼみと共に明らかに観察される。定性的およびリアルタイムRT-PCRは、神経成長因子およびインターロイキン-6発現レベルを決定するために使用されます。最終的に、ウエスタンブロッティングと免疫染色法が行われ、神経成長因子の量を検出します。この報告は、炎症時のmRNAおよびタンパク質変化の評価のために、冷熱酵素消化が真皮から表皮を分離する有効な方法であることを示している。
Introduction
皮膚からの炎症性メディエーターおよび神経栄養因子の評価は、炎症を起こした真皮および表皮1、2、3に見られる細胞タイプの不均一性に起因して制限され得る。いくつかの酵素、化学的、熱的、または評価のために細胞解離を行うための2つの層の分離を伴う機械的技術が最近4に見直されている。酸、アルカリ、中性塩、熱は表皮を真皮から素早く分けることができるが、細胞外腫脹は5,6で起こることが多い。トリプシン、膵臓、エラスターゼ、ケラチナーゼ、コラゲナーゼ、プロナーゼ、ディスパーゼ、およびサーリシンは、表皮皮膚分離4、7に使用されてきた酵素である。トリプシンやその他の広いスケールのタンパク質分解酵素は37~40°Cで活性ですが、表皮層の解離を防ぐために注意深くモニタリングする必要があります。ディスパーゼは、薄層デンサで表皮を切断するが、37°C4、9で冷たい4、8または短いタイムポイントで分離するために24時間を必要とする。これらすべての技術の制限的な特徴は、組織形態の潜在的な破壊およびmRNAおよびタンパク質の完全性の喪失である。
mRNAとタンパク質の完全性を維持するために、皮膚分離方法は、短時間の間、寒さの中で行われるべきである。炎症研究のための皮膚分離技術を評価する際に、サーリシンは、寒い温度4で真皮から表皮を分離するのに有効な酵素である。サーモリシンは、4°Cで活性であり、表皮ヘミデスモソームを層のルシダから切断し、表皮を1-3 h4、8、10以内の真皮から分離する。このレポートの目的は、炎症を起こしたラット表皮を真皮から分離して、炎症性メディエーターおよび神経栄養因子のmRNAおよびタンパク質レベルを検出するためのサーモリシンの使用を最適化することです。いくつかの予備的なレポートが提示されています11,12,13,14,15.本稿の目的は、サーモリシンを用いた最適な皮膚分離技術を記述し、1)炎症の1)マーカーの検出を実証することである、2)インターロイキン-6(IL-6)mRNA、および3)神経成長因子(NGF)mRNAおよびカラギーゲン誘導性炎症を有するラットの表皮中のタンパク質(C-II)16,17。完全なフロイントアジュバントモデルを用いた予備報告は、NGF mRNAおよびタンパク質レベルが炎症の間に早期に増加することを示す15。マウスにおいて、オキサゾロンの局所適用による皮膚感作は、その後ハイブリダイゼーション36に使用するIL-6 mRNAの早期上昇を引き起こす。IL-6とNGFはいずれもC-II18,19に関与しているが、C-IIの急性期の表皮から特異的に表皮からmRNAまたはタンパク質レベルを記述する報告はない。
サーモリシン技術は安価で、実行が簡単です。さらに、真皮からの表皮のサーモリシン分離は、炎症の過程におけるmRNA、ウェスタンブロット、および炎症の過程における炎症性メディエーターおよび神経栄養因子の免疫組織化学的分析を可能にする15。研究者は、皮膚の炎症の前臨床および臨床研究の両方でこの技術を簡単に使用できるはずです.
Protocol
このプロトコルは、オクラホマ州立大学保健科学センターIACUC(#2016-03)の動物ケアガイドラインに従います。 1. カラギーナンによる炎症(C-II) イゾフルラン(または注射麻酔薬)で男性および/または雌のスプレイグ・ドーレーラット(200〜250 g;8〜9週齢)を麻酔する。 角膜に触れ、左後足を軽くつまんで麻酔の深さを確認します。動物が適切に麻酔を受けると、角?…
Representative Results
ラット後足へのカラギーナン注射は、赤みや浮腫16、17などの炎症の古典的な症状を引き起こした。後足の腫れをメカニカルキャリパー20で測定した。カラギーナン処理前に各ラットについて足の厚さのベースライン値を得て、6時間および12時間で再び測定した。足の厚さはベースライン値と比較して有意に増加した(<strong class="xfig…
Discussion
この研究では、ラット後ろ足グラブロス皮膚の表皮は、2.5時間4°Cで1mMの塩化カルシウムを用いたPBSのサーモリシン(0.5 mG/mL)を使用して真皮から容易に分離されると判断した。組織学的評価により、表皮は基膜の真皮から分離され、表皮のレテ尾根はそのままであった。サーモライシンは、グラム陽性(ジオ)サーモプロテオリティクス24によって産生される細胞外…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究のための資金は、国立衛生研究所NIH-AR047410(KEM)によって提供されました
Materials
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
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Cite This Article
Gujar, V., Anderson, M. B., Miller, K. E., Pande, R. D., Nawani, P., Das, S. Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein. J. Vis. Exp. (175), e59708, doi:10.3791/59708 (2021).