High-throughput analyse van optische toewijzingsgegevens met behulp van ElectroMap

1. verzameling van optische toewijzingsgegevens Cardiale optische mapping uitvoeren met behulp van een van een breed scala van experimentele modellen, met inbegrip van intact en geïsoleerde hele harten6,18, geïsoleerde atria14,19, ventriculaire wiggen20, hart schijfjes 21 , 22, en cellulaire monolagen23. Zie de bijbehorende verwijzingen naar experimentele ontwerpen voor het verzamelen van onbewerkte optische toewijzingsgegevens van deze preparaten. Op voorwaarde dat de verkregen gegevens kunnen worden geconverteerd naar een TIFF-stapel of worden opgeslagen in een. MAT-bestand, moet het worden analyseerbaar met behulp van ElectroMap. Dit omvat gegevens van verschillende afmetingen (vierkant/rechthoekig) en resoluties (maximaal getest op dit moment 2048 pixels x 2048 pixels). 2. software installeren en opstarten Opmerking: Hieronder vindt u gedetailleerde de twee methoden voor het installeren en uitvoeren van ElectroMap-hetzij binnen MATLAB uitvoeren vanaf de bron (. m) code of als een standalone uitvoerbaar bestand (. exe voor Windows). De uiteindelijke software en de functionaliteit ervan zijn invariant tussen de twee Setup-opties (anders dan een paar verschillen in de Directory navigatie). Daarom zijn de belangrijkste overwegingen voor het kiezen van de versie te installeren toegang tot MATLAB en vereiste gereedschapskisten en of toegang tot broncode gewenst is. Waar mogelijk wordt aanbevolen om de MATLAB-versie te gebruiken voor snellere opstarttijden, Kortere verwerkingstijden en eenvoudigere foutrapportage. Installatie 1: electromap uitvoeren binnen MATLAB Installeer MATLAB. ElectroMap is ontworpen in MATLAB 2017a, maar software is getest voor gebruik in alle volgende releases van MATLAB (tot 2018b op het moment van schrijven). De volgende gereedschapskisten zijn vereist: beeldverwerking, signaalverwerking, statistiek en machine learning, en fitting van de curve. Download/kloon alle bestanden van de nieuwste ‘ source code ‘ release van electromap uit de GitHub repository (https://github.com/CXO531/ElectroMap). Unzip de gedownloade inhoud naar een gewenste locatie. Open MATLAB en navigeer naar de maplocatie die de broncode van de elektro kaart host. Open vervolgens het bestand electromap. m en druk op run in de editor, of typ ook electromap in het opdrachtvenster en druk op return. Hiermee start u de ElectroMap-gebruikersinterface, Figuur 1a. Setup 2: zelfstandig. exe-bestand Download het installatiebestand: https://drive.google.com/open?id=1nJyI07w9WIt5zWcit0aEyIbtg31tANxI. Volg de instructies in het installatieprogramma, die zal downloaden vereist de MATLAB-runtime van het web naast ElectroMap software. Voer Electromap. exeuit.Opmerking: opstarttijd voor de zelfstandige versie kan enkele minuten duren. 3. afbeelding laden en voorbewerken Druk op Selecteer map en navigeer naar de locatie van het te analyseren gegevensbestand (en). Hiermee vult u de linker ListBox met alle bestanden in die map die van het juiste bestandstype zijn (. TIF of. MAT). . MAT-bestanden mogen alleen de afbeeldings stack variabele bevatten.Opmerking: alleen mappen en geen afzonderlijke bestanden worden weergegeven wanneer u door de Mapkiezer navigeert. Selecteer bestand dat vanuit de interface moet worden geladen en druk op afbeeldingen laden. Eenmaal geladen, zal het eerste frame verschijnen en de rode omtrek geeft de automatische drempel van de afbeelding aan. Indien nodig, reload eerder gebruikte ROIs door te selecteren Opslaan/load ROI. In dit geval slaat u stap 3,3 over. Standaard is drempelmethode gebaseerd op de pixel intensiteiten in het eerste frame. Wijzig indien gewenst de drempelwaarde op basis van de amplitude van de signaal tijd cursus door de optie in het dropdown-menu afbeelding voor drempel te wijzigen. Let op: zodra de drempel is geselecteerd, wordt deze vervolgens toegepast voor de hele afbeeldingsstapel. Wijzig desgewenst de optie drempel in handmatig, waarmee de schuifregelaar wordt geactiveerd om de afbeeldings drempel handmatig aan te passen. Bovendien, bijsnijden van afbeeldingen (afbeelding bijsnijden) en/of teken een aangepaste regio van belang (aangepaste ROI) voor analyse door het selecteren van de juiste selectievakje (sen) onder drempel opties. Houd er rekening mee dat geavanceerde opties voor de regio van interesse selectie, zoals het aantal gebieden zijn beschikbaar via ROI selectie in het bovenste menu. Zodra een geschikte drempel is toegepast, drukt u op proces afbeeldingen om de verwerking toe te passen. Instellingen voor verwerking worden hieronder beschreven (stap 3.4.1-3.4.5). Zorg er op dit moment voor dat de juiste camera-instellingen zijn ingevoerd. Dit zijn de pixelgrootte in ΜM (belangrijk: dit is de pixelgrootte van de afbeelding en niet de grootte van de pixels die de chip of equivalente hardware in het imaging-apparaat vormen) en framerate in kHz. Vink voor signaal inversie het selectievakje gegevens omkeren aan om in te schakelen. Indien gerapporteerd fluorescerende signaal omgekeerd evenredig aan parameter van belang (zoals met veelgebruikte potentiometrische kleurstoffen) het signaal kan worden omgekeerd. Voor ruimtelijke filtering selecteert u Gaussian of Average in het kernelmenu. De grootte van het spatiaal gemiddelde gebied wordt bepaald door de grootte -ingang naast het vervolgkeuzemenu van de kernel (d.w.z. 3 resulteert in een filter kernel van 3 pixel x 3 pixels). Bij het aanbrengen van een Gaussiaanse filter kan de standaarddeviatie ook worden ingesteld vanuit de Sigma -ingang. Voor correctie op basislijn, selecteer Top-Hat24 of polynomiale (4th of 11th graden) correctie25 in het menu basislijn . Correctie kan worden toegepast op elke pixel afzonderlijk (lange verwerkingstijd) of als een gemiddelde van de gehele afbeelding (sneller, maar veronderstelt homogene Baseline wijzigingen). Top-Hat correctie kan ook worden gewijzigd door het instellen van de lengte van de Top-Hat in milliseconden, grenzend aan de basislijn selectie vervolgkeuzemenu. De lengte van de Top-Hat kernel moet groter zijn dan de tijdschaal van de individuele actie potentials/calcium transients. Voor tijdelijke filtering selecteert u Savitzky-Goaly of Infinite Impulse (IIR) filtering in het filter menu.Opmerking: anders dan voor het gemiddelde weefsel signaal dat linksonder wordt weergegeven, wordt tijdelijke filtering toegepast op elke pixel afzonderlijk op het moment dat de parameter kwantificering van de gemiddelde afbeeldingsreeksen van het ensemble wordt gebruikt. Dit is geïmplementeerd om de verwerkingstijd te verkorten door kleine gedeelten van gegevens te filteren wanneer dat nodig is in plaats van hele bestanden. Houd er bij het verwijderen van frames rekening mee dat als de optie kaders verwijderen is geselecteerd, grote pieken met een amplitude groter dan het signaal van belang kunnen worden verwijderd uit de afbeeldingsset. Dit kan nuttig zijn in optisch tempogegevens sets zoals optogenetische pacing waar depolarisatie wordt geïnitieerd door optische activering van opsins zoals channelrhodopsin 211,12.Opmerking: als het frame verwijderen zal mogelijk leiden tot onfysiologische stap wijzigingen in de beeldsignalen, temporele filtering kan artefacten introduceren om de gegevens en dus wordt hier niet aanbevolen. Merk op dat het signaal wordt gesegmenteerd zodra de proces afbeeldingen zijn geselecteerd op basis van de opties onder segmentatie opties, maar dit kan snel worden gewijzigd zonder de volledige gegevensset opnieuw te verwerken (zie sectie 4). 4. data segmentatie en ensemble middeling Opmerking: zodra het bestand is verwerkt, zullen pieken in het gemiddelde signaal van het weefsel (rechtsonder traceren, Figuur 1a) zijn gedetecteerd en geëtiketteerd door rode cirkels. Alleen pieken boven een ingestelde drempelwaarde (blauwe lijn op trace die is ingesteld met piek drempelwaarde) worden geteld. Bovendien worden pieken alleen geteld als ze voldoende vertraagd zijn in vergelijking met de vorige pieken, ingesteld door de min piek afstand ingang. Signaal wordt vervolgens gesegmenteerd op basis van de gedetecteerde pieken. Ten eerste wordt de effectieve cyclus lengte (CL) van elke piek berekend door het meten van de tijd ertussen en de volgende piek. Als een aantal pieken (ingesteld door Min aantal pieken input) vergelijkbare CLs (drempelwaarde die is ingesteld door de minimale grens ingang) dan zijn ze gegroepeerd en de gemiddelde cl voor die pieken berekend. Druk op segment signaalvoor verdere segmentatie van de gegevens. Opties voor sub-segmentatie zijn: geen – alle pieken met dezelfde cl gegroepeerd; Alle – segmenten van npieken binnen de constante cl tijden (npieken wordt bepaald door de segment grootte input) worden geïdentificeerd; Laatste – laatste nPIEKEN voordat een cl verandering worden geïdentificeerd en gegroepeerd, en alle andere worden niet geanalyseerd; en Single beat -dit is gelijk aan het toepassen van de alle segmentatie met npieken = 1, en dus geen groepering of ensemble middeling (zie 4,5) worden toegepast. Dit kan worden toegepast door het selecteren van de Single beat knop. Pas aangepaste segmentatie van het signaal toe door in te zoomen op een tijd van interesse en segment signaalte selecteren. Hiermee voegt u een extra optie met de titel ingezoomde sectie toe aan de keuzelijst sectie, die overeenkomt met de geselecteerde tijdspunten. De resultaten van de segmentatie zullen verschijnen in de lijst-Box grenzend aan het weefsel gemiddelde signaal, en zal tonen sectienummer en de geschatte CL. Alle gesegmenteerde tijd secties worden aangeduid met verschillende kleuren. Selecteer een segment in de keuzelijst om die sectie in het rood te markeren. Dit zal ook automatisch leiden tot analyses van deze sectie, alsof de knop kaarten produceren is geselecteerd (zie rubriek 5). Analyses van gegroepeerde pieken zullen worden uitgevoerd op de ‘ ensemble middelaged ‘ gegevens. Dit betekent dat de pieken in een segment samen worden berekend, waarbij de referentie tijden de pieken zijn die in stap 4,2 zijn geïdentificeerd. Werk het tijdvenster bij tot het gemiddelde door de ingangen voor en na te wijzigen en op segment signaalte drukken. 5. actiepotentiaal/calcium voorbijgaande duur en geleiding Velocity analyse Zodra de afbeeldingen zijn verwerkt, wordt de knop ‘ Produceer Maps ‘ actief. Druk op produce Maps om actiepotentiaal duur (apd), activeringstijd, geleidings snelheid en SNR-analyse toe te passen. Standaard wordt de analyse toegepast op het eerste signaal segment. Selecteer andere segmenten in de lijst-box zal analyse toepassen op gekozen segment.Opmerking: resultaten van de analyse worden weergegeven in de resultatentabel, met inbegrip van gemiddelde, standaarddeviatie, standaardfout, variantie en 5e tot en met 95e percentiel analyse. Duur kaarten worden ‘ APD ‘ kaarten genoemd echter, calcium signalen verwerkt met behulp van dezelfde instellingen zal calcium voorbijgaande duur meten. Selecteer pixel info ophalen om een gedetailleerde weergave van het signaal van een willekeurige pixel in de afbeelding te zien en vergelijk pixels om tegelijkertijd signalen van maximaal 6 locaties te tekenen. Gebruik het paneel signaalverwerking om instellingen voor duur analyse aan te passen. Dit zijn: duur – tijd van percentage repolarisatie/verval op maat van piek; ‘ Apd ‘ baseline – tijdsperiode van signaal dat is gedefinieerd als referentie basislijn voor amplitude metingen; en ‘ apd ‘ starttijd – starttijd voor duur metingen. Dit zijn dezelfde opties voor het bepalen van de activeringstijd voor isochronal-kaarten (hieronder besproken) en worden aangeduid als: start (d2F/DT2Max), upstroke (DF/DTMax), depolarisatie middelpunt (tijd van 50% amplitude), piek (tijd van maximale amplitude). Deze definities voor muis-en cavia-actie potentialen worden weergegeven in Figuur 2a.Opmerking: als u een van deze opties wijzigt, worden de duur kaart en de resultatentabel automatisch bijgewerkt. Kaartschaal en uitschieter verwijderingsopties zijn ook beschikbaar. Conductie snelheid wordt ook automatisch gemeten binnen de HoofdSoftware-interface. Dit wordt bereikt met behulp van de multi-vector methode van Bayly et al26 van de isochronal-kaart die is gedefinieerd door de gekozen activerings maatregel (besproken in stap 5,4). Druk op activerings punten om een 3D-weergave van de activerings kaart te genereren. De multi-vector geleidings snelheid meetmethode segmenteert de isochronal-kaart ruimtelijk in gebieden van n x n pixels. Stel de waarde van n in met de invoer van het lokale vensterformaat en stel het bereik van de activeringstijden in om de analyse toe te passen op de invoer van de aanpassings tijden .Opmerking: voor elke lokale regio is een veelterm oppervlak, f, gemonteerd dat het beste de relatie beschrijft tussen activeringstijd en ruimtelijke positie, (x,y). De gradiënt Vector ,lokaalCV, van dit oppervlak wordt vervolgens als volgt berekend:1waarbij de tweedimensionale Cartesische ruimtelijke differentiaaloperator26wordt aangeduid. Voor elke pixel in de isochronal-map wordt een lokale vector berekend die de snelheid en richting van de geleiding weergeeft. Selecteer isochronal-kaart met vectoren in het dropdown-menu weergeven om deze analyse te bekijken. SNR wordt berekend als de verhouding van de maximale amplitude ten opzichte van de standaarddeviatie van het signaal bij Baseline. Deze analyse wordt uitgevoerd na alle verwerkingsstappen. Druk op de SNR-berekening in het bovenste menu om instellingen te bewerken voor de periode van het signaal dat als basislijn is gedefinieerd. 6. geleidings analyse module Pers geleiding voor toegang tot een gedetailleerdere analyse van de geleidings snelheid. Dit opent een aparte module waar de geleiding kan worden gekwantificeerd met behulp van de Bayly multi-vector methode zoals in de Hoofdinterface, enkele vector methoden, en als een activerings curve. Druk op enkele vector om de geleiding te analyseren met behulp van de enkele vector methode, waarbij CV wordt berekend op basis van de vertraging in de activeringstijd tussen twee punten. Dit kan worden gedaan met behulp van automatische of handmatige methoden, selecteerbaar onder de enkele vector knop. Voor automatische enkelvoudige Vector methode selecteert u een afstand en startpunt voor het meten van de geleiding. De software voert vervolgens een sweep van 360 graden uit vanaf het geselecteerde punt, waarbij de tijdsvertraging wordt gemeten en de bijbehorende geleidings snelheid langs alle richtingen in stappen van 1 graden wordt berekend. De resultaten van deze analyse worden weergegeven in de grafiek naast de kaart en de richting van de traagste geleiding wordt rood weergegeven. Voorhand matige enkelvoudige Vector methode kiest u zowel een start-als een eindpunt van de isochronal-kaart om de geleidings snelheid te berekenen. Als u een nieuw startpunt wilt selecteren, drukt u op Clear start Point. Druk op lokale vector om de multi vector-methode toe te passen, met de instellingen die overeenkomen met die van de Hoofdinterface. Binnen de geleidings module kan de verdeling van geleidings snelheden, evenals de hoekige verdeling van berekende vectoren en hoek afhankelijkheid van geleidings snelheid worden weergegeven. Druk op activerings curve om het percentage van het weefsel dat als functie van de tijd is geactiveerd, te tekenen. Tijd tot 100% activering wordt automatisch weergegeven, terwijl aangepaste waarden voor minimale (blauwe) en maximale (rode) activerings percentages waartussen te meten ook kunnen worden geselecteerd. 7. aanvullende analyses en modules Afgezien van de automatisch uitgevoerde duur en geleidings snelheid analyses, kunnen verschillende andere parameters worden gekwantificeerd met behulp van ElectroMap. Deze analyses zijn selecteerbaar in het dropdown menu boven de display kaart. Selecteer een van deze opties om de analyse uit te voeren en de resultaten worden weergegeven in de 4e rij van de resultatentabel: 1) diastolische interval – tijd van 90% repolarisatie naar activeringstijd van de volgende actiepotentiaal; 2) dominante frequentie – frequentiespectrum van elke pixel wordt berekend met behulp van de snelle Fourier-transformatie, en de frequentie met de meeste macht wordt gedefinieerd als de dominante frequentie. Geavanceerde bereik-en venster instellingen voor een dominante frequentie analyse zijn beschikbaar door het selecteren van frequentietoewijzing; 3) time to Peak – de stijgtijd tussen twee door de gebruiker geselecteerde percentages (standaard 10 tot 90%) van de depolarisatie fase van het actiepotentiaal of het vrijkomen van calcium. Percentage waarden kunnen worden gewijzigd door TTP-instellingente selecteren; en 4) ontspannings constante (τ) – ontspannings constante wordt berekend door een mono-exponentieel verval van de vorm van de vorm te monteren:2Wanneer het fluorescentie niveau op tijd t afhangt van de piek fluorescentie, F0, en het daaropvolgende verval (C is een constante)27. De waarde die moet worden aangepast aan vergelijking 2, is selecteerbaar binnen de Hoofdgebruikers interfaces van de elektro kaart, evenals een goedheid van de uitsluitingscriteria voor passen op basis van de r2 -waarde. Druk op analyse van één bestand om een speciale module te openen voor een hoge doorvoer duur en een geleidings analyse van elk geïdentificeerd segment in een bestand. Analyse kan worden uitgevoerd op de hele afbeelding (duur, geleiding en activeringstijd) of op geselecteerde regio’s of nuttige punten (momenteel alleen duur). Resultaten worden gegenereerd naar een CSV-bestand.Opmerking: voor APD-waarden uit de hele afbeelding is de eerste kolom in het CSV-bestand het gemiddelde, terwijl de tweede kolom de standaarddeviatie is. Druk op Alterzen om een standalone module te initiëren voor specifieke analyse en mapping van Beat-to-beat variabiliteit. Zie O’Shea et al. 201913 voor meer informatie over alternatieven voor verwerking en analyse. Specifiek, deze module is ontworpen om te identificeren twee periode oscillaties, bekend als plaatsvervankers. Zowel de duur als de amplitude afwisselend worden berekend en gegenereerd.Opmerking: duur vervangen worden gemeten door de duur meting te vergelijken van de ene piek naar de volgende; d.w.z. als respectievelijk piek één en twee en APD1 en apd2 , dan wordt de duur alternan (δapd) berekend als3De duur meting wordt uitgevoerd met behulp van de instellingen in de Hoofdinterface. Ondertussen kunnen amplitude-alternatieven worden gekwantificeerd en in kaart gebracht over multi-cellulaire preparaten als absolute verandering (gedefinieerd als een percentage waarbij 0% = dezelfde amplitude tussen één beat en de volgende). Bovendien kunnen de effecten van verschijnselen zoals calcium belasting verder worden onderzocht door het meten en vergelijken van belasting en vrijgekomen plaatsvervankers, zoals eerder gemeld28. Als L wordt gedefinieerd als de piek amplitude van de grote beats (d.w.z. waar de amplitude groter is dan de vorige Beat), S de amplitude van de kleine beats, enD de diastolische belasting van de kleine beats, de release alterzen ( ) worden gedefinieerd als:4Omgekeerd worden belasting vervankers () gedefinieerd als:5Plaatsvervankers kunnen worden gemeten over het hele weefsel en de resultaten van de analyse worden rechtsonder in de module weergegeven. Wanneer u de module voor het eerst gebruikt, wordt de analyse uitgevoerd over het hele experimentele bestand en de weergegeven resultaten zijn een gemiddeld Beat-Beat verschil over het hele bestand. De analyse kan echter worden beperkt tot specifieke tijden in het bestand door het selecteren van de Hold-zoom, het inzoomen op een bepaalde periode en het selecteren van de uitgezoomde sectie. Hiermee wordt het deelvenster resultaten bijgewerkt om de analyse van de geselecteerde periode weer te geven. Selecteer afspelen om een beat-to-beat video van de alternatieven analyse weer te geven. Selecteer bovendien maken mean-kaart om een kaart van het alternatieven gedrag te exporteren vanaf de tijdpunten selecteren, die zijn ingesteld in het pop-upmenu wanneer u deze functie gebruikt. Druk op Phase map om de fase mapping module te starten. Een Hilbert-transformatie wordt uitgevoerd om de momentane fase (tussen-π en + π) van de signalen op elk tijdpunt te berekenen. Druk op de schuifregelaar afspelen of slepen om fase gedrag na verloop van tijd te visualiseren en klik op een pixel om een fase diagram weer te geven. 8. gegevens exporteren Gegevens worden geëxporteerd vanuit ElectroMap in verschillende vormen. Druk op export waarden om de waarden van de momenteel weergegeven kaart op te slaan in de hoofdgebruikte interface. Gemeten waarden kunnen worden opgeslagen als een kaart (behoud van pixel locaties) of gecondenseerd in een enkele lijst en kunnen worden opgeslagen als. CSV,. txt of. MAT bestanden. Druk op export map om een pop-up met de momenteel weergegeven kaart te brengen, die vervolgens kan worden opgeslagen in een verscheidenheid aan afbeeldingsformaten. Weergaveopties voor de kaart worden bestuurd door kaartinstellingen te selecteren, maar kunnen ook worden bewerkt nadat de export kaart is geselecteerd. U bijvoorbeeld een kleurenbalk toevoegen door dit pictogram in het bovenste menu te selecteren en de schaal kan worden ingesteld door > Colormap bewerken te selecteren. Druk op activerings video om een animatie van de activerings reeks weer te geven, die kan worden opgeslagen als een geanimeerd. GIF-bestand. Druk op segment video om een AVI-videobestand op te slaan van de momenteel weergegeven parameter van elk geïdentificeerd segment.