Ein semi-quantitativer Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) Assay zur Untersuchung der Rapamycin/mTOR-Interaktion
Summary
In dieser Studie haben wir die Datenanalysefunktionen des DARTS-Experiments verbessert, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität überwacht enden und die Affinität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen schätzen. Die Wechselwirkungen können in zwei Kurven dargestellt werden: eine proteolytische Kurve und eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve. Wir haben die mTOR-rapamycin-Interaktion als beispielhaften Fall genutzt.
Abstract
Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) ist eine robuste Methode zum Nachweis neuartiger Proteinziele für kleine Moleküle. Es kann verwendet werden, um bekannte kleine Molekül-Protein-Wechselwirkungen zu überprüfen und potenzielle Proteinziele für natürliche Produkte zu finden. Im Vergleich zu anderen Methoden verwendet DARTS native, unveränderte, kleine Moleküle und ist einfach und einfach zu bedienen. In dieser Studie haben wir die Datenanalysefähigkeiten des DARTS-Experiments weiter verbessert, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität überwachten und die Affinität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen schätzten. Die Protein-Ligand-Wechselwirkungen können in zwei Kurven dargestellt werden: eine proteolytische Kurve und eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve. Wir haben die mTOR-rapamycin Interaktion als beispielhaftes Argument für die Erstellung unseres Protokolls genutzt. Aus der proteolytischen Kurve sahen wir, dass die Proteolyse von mTOR durch Pronase durch das Vorhandensein von Rapamycin gehemmt wurde. Die Dosis-Abhängigkeits-Kurve ermöglichte es uns, die Bindungsaffinität von Ramamycin und mTOR abzuschätzen. Diese Methode ist wahrscheinlich eine leistungsfähige und einfache Methode zur genauen Identifizierung neuartiger Zielproteine und zur Optimierung des Wirkstoffzielengagements.
Introduction
Die Identifizierung kleiner Molekül-Zielproteine ist für das mechanistische Verständnis und die Entwicklung potenzieller therapeutischer Medikamentewesentlich 1,2,3. Die Affinitätschromatographie als klassische Methode zur Identifizierung der Zielproteine kleiner Moleküle hat gute Ergebnisse erbracht4,5. Diese Methode hat jedoch Grenzen, da die chemische Modifikation kleiner Moleküle oft zu einer reduzierten oder veränderten Bindungsspezifität oder Affinität führt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden kürzlich mehrere neue Strategien entwickelt und angewendet, um die kleinen Molekülziele ohne chemische Modifikation der kleinen Moleküle zu identifizieren. Diese direkten Methoden zur Zielidentifikation von etikettenfreien kleinen Molekülen umfassen die wirkstoffaffinitätsresponsive Zielstabilität (DARTS)6, Stabilität von Proteinen aus Oxidationsraten (SPROX)7, zellulärer thermischer Schichtassay (CETSA)8 ,9und thermische proteom profiling (TPP)10. Diese Methoden sind sehr vorteilhaft, da sie natürliche, unveränderte kleine Moleküle verwenden und sich nur auf direkte Bindungswechselwirkungen verlassen, um Zielproteine zu finden11.
Unter diesen neuen Methoden ist DARTS eine vergleichsweise einfache Methode, die leicht von den meisten Labors übernommen werden kann12,13. DARTS hängt von dem Konzept ab, dass Ligandengebundene Proteine eine modifizierte Anfälligkeit für enzymatische Degradation im Vergleich zu ungebundenen Proteinen aufweisen. Das neue Zielprotein kann durch Untersuchung des veränderten Bandes im SDS-PAGE-Gel durch flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) nachgewiesen werden. Dieser Ansatz wurde erfolgreich für die Identifizierung von bisher unbekannten Zielen von Naturprodukten und Medikamenten14,15,16,17,18 , 19. Es ist auch leistungsfähig als Mittel, um die Bindung von Verbindungen an ein bestimmtes Protein zu überprüfen oder zu validieren20,21. In dieser Studie stellen wir eine Verbesserung des Experiments dar, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität mit kleinen Molekülen überwachen und Protein-Ligand-Bindungsaffinitäten identifizieren. Wir verwenden mTOR- rapamycin Interaktion als Beispiel, um unseren Ansatz zu demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
DARTS ermöglicht die Identifizierung kleiner Molekülziele, indem die schützende Wirkung der Proteinbindung gegen Abbau genutzt wird. DARTS erfordert keine chemische Modifikation oder Immobilisierung des kleinen Moleküls26. Dadurch können kleine Moleküle verwendet werden, um ihre direkten Bindungsproteinziele zu bestimmen. Zu den Standardbewertungskriterien für die klassische DARTS-Methode gehören Gelfärbung, Massenspektrometrie und Western Blotting12,<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH-Forschungsstipendien R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484 und ein DOD-Forschungsstipendium W81XWH-16-1-0482 unterstützt.
Materials
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
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