में इन विट्रो ट्रांशबेड आरएनए-आधारित Luciferase रिपोर्टर परख Poxvirus में अनुवाद विनियमन का अध्ययन करने के लिए-संक्रमित कोशिकाओं
Summary
हम poxvirus में mRNA अनुवाद विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद-संक्रमित कोशिकाओं इन विट्रो प्रतिलिखित आरएनए-आधारित luciferase रिपोर्टर परख का उपयोग कर । परख सीआईएसद्वारा अनुवाद विनियमन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-एक mrna के तत्वों, सहित 5 ‘-अनअनुवादित क्षेत्र (utr) और 3 ‘-utr । विभिंन अनुवाद दीक्षा मोड भी इस विधि का उपयोग कर जांच की जा सकती है ।
Abstract
हर poxvirus एमआरएनए वायरल डीएनए प्रतिकृति के बाद लिखित एक विकास संरक्षित है, गैर-5 templated ‘-पाली (5 में एक नेता)-utr । 5 की भूमिका के टुकड़े टुकड़े करने के लिए ‘-पॉली (एक) poxvirus संक्रमण के दौरान mRNA अनुवाद में नेता हम एक इन विट्रो प्रतिलिखित आरएनए-आधारित luciferase रिपोर्टर परख विकसित की है । इस रिपोर्टर परख चार मूल कदम शामिल हैं: (1) पीसीआर में इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए डीएनए टेम्पलेट बढ़ाना; (2) में विट्रो ट्रांसक्रिप्शन T7 आरएनए पॉलीमरेज का उपयोग कर mRNA उत्पन्न करने के लिए; (3) संक्रमण कोशिकाओं में mRNA प्रतिलिखित इन विट्रो में लागू करने के लिए; (4) अनुवाद के संकेतक के रूप में luciferase गतिविधि का पता लगाने । आरएनए-आधारित luciferase संवाददाता परख यहां वर्णन किया गया है प्लास्टिक की poxvirus में प्रतिकृति के मुद्दों-संक्रमित कोशिकाओं और प्लाज्मिड से गुप्त ट्रांसक्रिप्शन । यह प्रोटोकॉल poxvirus-संक्रमित कोशिकाओं के अलावा अन्य प्रणालियों में 5 ‘-UTR और 3 ‘-UTR सहित एक mRNA में सीआईएसतत्वों द्वारा अनुवाद विनियमन निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, इस विधि का उपयोग कर कैप-निर्भर, कैप-स्वतंत्र, पुनर्दीक्षा, और आंतरिक दीक्षा जैसे अनुवाद के विभिन्न माध्यमों की जांच की जा सकती है ।
Introduction
केंद्रीय हठधर्मिता के अनुसार, आनुवंशिक जानकारी डीएनए से आरएनए के लिए बहती है और फिर अंत में प्रोटीन के लिए1,2। आनुवंशिक जानकारी के इस प्रवाह अत्यधिक mrna अनुवाद3,4सहित कई स्तरों पर विनियमित है । रिपोर्टर का विकास जीन की अभिव्यक्ति के नियमन को मापने के लिए इस प्रक्रिया में शामिल नियामक तंत्रों की समझ को सुगम बनाएगा । यहाँ हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए mRNA अनुवाद का उपयोग करते हुए एक इन इन विट्रो ट्रांज़ेक्टड आरएनए-आधारित में luciferase रिपोर्टर परख poxvirus में संक्रमित कोशिकाओं.
Poxवायरसों में कई बेहद खतरनाक मानव और पशु रोगज़नक़ों शामिल हैं । अंय सभी वायरस की तरह, poxवायरसों विशेष रूप से प्रोटीन संश्लेषण6,7,8के लिए मेजबान सेल मशीनरी पर भरोसा करते हैं । प्रभावी रूप से वायरल प्रोटीन synthesize करने के लिए, वायरस सेलुलर अनुवाद मशीनरी का अपहरण करने के लिए यह वायरल mrnas7,8के लिए अनुप्रेषित करने के लिए कई रणनीतियों विकसित की है । वायरस द्वारा सामान्य रूप से नियोजित एक तंत्र अपने ट्रांस्क्रिप्ट में सीआईएस-एक्टिंग तत्वों का उपयोग करने के लिए है । उल्लेखनीय उदाहरण आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट (ires) और कैप स्वतंत्र अनुवाद बढ़ाने (CITE)9,10,11शामिल हैं । इन सीआईएसतत्वों को विविध तंत्र12,13,14के माध्यम से ट्रांसलेशनल मशीनरी को आकर्षित करने के द्वारा वायरल टेप एक स्थानांतरीय लाभ प्रदान करते हैं । अधिक से अधिक १०० poxvirus mrnas है एक विकास संरक्षित सीआईएस-अभिनय तत्व in the 5 ‘-अअनुवादित क्षेत्र (5 ‘-utr): a 5 ‘-पाली (ए) नेता इन mrnas के बहुत 5 ‘ समाप्त होता है15,16। इन 5 ‘-पॉली (A) नेताओं की लंबाई विषम है और ट्रांसक्रिप्शन17,18के दौरान poxvirus-एंकोडेड आरएनए पोलीमरेज के फिसलन से उत्पन्न होती है । हम, और दूसरों, हाल ही में पता चला कि 5 ‘-पाली (ए) के नेता एक mrna के लिए एक अनुवाद लाभ प्रदान करता है गोशीतला वायरस (vacv), poxviruses के prototypic सदस्य से संक्रमित कोशिकाओं में19,20।
इन विट्रो ट्रांज़ेक्टड आरएनए-आधारित luciferase रिपोर्टर परख शुरू में 5 ‘ की भूमिका को समझने के लिए विकसित किया गया था ‘ poxvirus संक्रमण के दौरान mrna अनुवाद में पाली (एक) नेता19,21। हालांकि प्लाज्मिड डीएनए आधारित luciferase रिपोर्टर assays हैं व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, वहाँ कई कमियां है कि poxvirus में परिणाम व्याख्या जटिल होगा-संक्रमित कोशिकाओं । सबसे पहले, plasmids VACV में दोहराने-संक्रमित कोशिकाओं22करने में सक्षम हैं । दूसरा, क्रिप्टिक ट्रांसक्रिप्शन अक्सर प्लाज्मिड डीएनए18,23,24से होता है । तीसरा, VACV प्रवर्तक-संचालित ट्रांसक्रिप्शन उत्पंन पाली (ए)-विषम लंबाई के नेता फलस्वरूप यह मुश्किल से पाली (एक)-कुछ प्रयोगों में नेता लंबाई को नियंत्रित करने के लिए बना18। एक में इन विट्रो प्रतिलिखित आरएनए आधारित luciferase रिपोर्टर परख circumvents इन मुद्दों और डेटा व्याख्या स्पष्ट है ।
इस विधि में चार प्रमुख चरण हैं: (1) पोलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए डीएनए टेम्पलेट जनरेट करने के लिए; (2) इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन में mRNA उत्पन्न करने के लिए; (3) कोशिकाओं में mRNA वितरित करने के लिए ट्रांसफैक्शन; और (4) अनुवाद के संकेतक के रूप में luciferase गतिविधि की पहचान (चित्रा 1). परिणामी पीसीआर amplicon 5 ‘ करने के लिए 3 ‘ दिशा में निम्नलिखित तत्व शामिल हैं: T7-प्रमोटर, पाली (ए) नेता या वांछित 5 ‘-UTR अनुक्रम, जुगनू luciferase ओपन रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) एक पाली (एक) पूंछ के बाद. पीसीआर amplicon T7 polymerase का उपयोग करते हुए इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन द्वारा mRNA synthesize करने के लिए टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है । इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के दौरान, एम7जी कैप या अन्य कैप एनालॉग को नव संश्लेषित एमआरएनए में शामिल किया जाता है । छाया हुआ टेप असंसंक्रमित या VACV संक्रमित कोशिकाओं में transfected कर रहे हैं । कोशिका lysate वांछित समय पर एकत्र करने के लिए luciferase गतिविधियों है कि अभिकर्मक से प्रोटीन उत्पादन का संकेत उपाय करने के लिए है mrna । इस रिपोर्टर परख 5 ‘-UTR, 3 ‘-UTR या एक mRNA के अन्य क्षेत्रों में मौजूद सीआईएस-तत्व द्वारा अनुवाद विनियमन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, इन विट्रो प्रतिलिखित आरएनए आधारित परख के लिए टोपी पर निर्भर दीक्षा, टोपी स्वतंत्र दीक्षा, फिर से दीक्षा और IRES की तरह आंतरिक दीक्षा सहित अनुवाद दीक्षा के विभिंन तंत्र का अध्ययन किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सभी चार कोर कदम में इन विट्रो प्रतिलिखित आरएनए-आधारित luciferase रिपोर्टर परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं । खासतौर पर T7 प्रमोटर सीक्वेंस के लिए प्राइमर डिजाइन पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए । T7 आर. एन. ए. पोल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
परियोजना के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था (AI128406 www.nih.gov) ZY और जॉनसन कैंसर रिसर्च सेंटर (http://cancer.k-state.edu) द्वारा भाग में स्नातक छात्र ग्रीष्मकालीन वजीफा के रूप में पीडी के लिए ।
Materials
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In-Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. . Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. . PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
