Лентивирные посредничества Джин Silencing в человека Pseudoislet Подготовлено в низких пластин присоединения

Потеря функциональной бета-клеточной массы является центральной патологией какдля диабета типа 1, так и для 2-го типа 1. В то время как бета-клетки являются производителями инсулина в островках поджелудочной железы, связь между бета-клетками и небета-клетками играет важную роль в регуляции секреции инсулина^2. Кроме того, дисрегуляция секреции глюкагона способствует гипергликемии при диабете³. Таким образом, существует большой интерес к модулировать экспрессию генов клеток в островках поджелудочной железы для решения механизма развития дисфункции островка при диабете. Различные подходы, включая трансгенных мышей доступны для модулировать экспрессию генов островков мыши. Тем не менее, человек и мышь островки показывают различные иннервации, распределение клеток, соотношение бета-клеток к альфа-клетки, и ответ на secretagogues⁴. Поэтому прямая оценка функции генов в островках человека чрезвычайно важна для понимания патофизиологии островков поджелудочной железы человека.

Аденовирусный вектор является наиболее широко используемым вирусным вектором для претворения островков поджелудочной железы в пробирке из-за высокой эффективности трансдукции в неразделяющихся клетках. Однако аденовирус не проникает в ядро островков эффективно, особенно в островки человека^5,и является цитотоксическим в высоких дозах^6. Сравнительно, лентивирусный вектор менее цитотоксичен и поставляет экзогенные гены постоянно в хромосому пост-митотических клеток, что делает его широко проверенным средством для генной терапии⁷. Тем не менее, способность лентивирус проникнуть в ядро нетронутых островков человека также ограничена, тем самым требуя частичной дисперсии путем ферментативного пищеварения для повышения эффективности трансдукции⁸. Предостережение с дисперсией нетронутых островков человека прерывание клеток и клеточной матрицы связи, которая ставит под угрозу динамическую регуляцию секреции инсулина решающее значение для поддержания гомеостаза глюкозы у людей⁹. Таким образом, было сложно оценить влияние модуляции генов на динамическую регуляцию островковой функции в модели островков человека.

Известно, что рассеянные островков ы токсы с островков человека и грызунов автономно реагрегатируются на островоподобные структуры, называемые «псевдоизлетами». Псевдоислеты показывают бета-и небета-клеточная дистрибуция, аналогичная родному островкам^10,11. Кроме того, после долговременной культуры, родные островкипостепенно теряют надежную первую фазу секреции инсулина 5,^10,11,12. Тем не менее, псевдоизлеты продемонстрировали лучшее сохранение секреции инсулина первой фазы в ответ на глюкозу по сравнению с местными островками после того же периода культуры⁵. В дополнение к лучшей секреции инсулина, контролируемые размером реагрегации клеток человека в низких пластинах крепления¹¹ предоставляет окно возможностей для введения лентивирусных векторов до их реагрегации в псевдовизлеты. Несколько исследований продемонстрировали полезность псевдоизлетов в сочетании с опосредования трансдукции лентивиральной. Caton et al.¹³ сообщили, что введение зеленого флуоресцентного белка (GFP), выражающего лентивирус, мало повлияло на секрецию инсулина при достижении однородного выражения ГФП в крысиных псевдоислетах по сравнению с неинфицированным контролем. Они также продемонстрировали специфическое влияние различных connexins на секрецию инсулина путем overexpressing connexins 32, 36, и 43 через lentivirus^13. Человеческие псевдовизлеты, подготовленные с коммерчески доступной 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления показали, что lentiviral-опосредованное переэкспрессия транскрипционного фактора SIX3 улучшает секрецию инсулина оценивается статической инкубации¹⁴. Недавно, человеческие псевдовизлеты, подготовленные с 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления были использованы для downregulate глюкокиназы через lentiviral короткой шпильки РНК (SHRNA) в качестве доказательства принципа, чтобы показать, что глюкоза стимулировали секреции инсулина уменьшается, в то время как KCl-стимулировали секрецию инсулина была сохранена⁵. Исследование также показало, что человеческие псевдоизоляторы похожи на родние островки в экспрессии генов и секреторных профилях, что еще больше поддерживает полезность человеческих псевдоизлетов для вскрытия регуляции островной функции^5. Хотя перифузия не была выполнена, биоинженерных микроколодцы культуры пластины, которые недавно стали коммерчески доступны, также сообщается, что совместимы для лентивирусной трансдукции и производства человеческих псевдоизоляторов, которые выставлены отличные инсулина секреция in vitro и in vivo после трансплантации¹¹. В совокупности, формирование человеческого псевдоистлета в сочетании с лентивирусной трансдукцией является простым и эффективным подходом к исследованию патологиологии островков человека, обеспечивая ценный инструмент для проведения механистических исследований на человеческих островках.

В настоящем докладе представлен протокол для формирования человеческих псевдоизоляторов, трансцизированных с помощью лентивирусной платформы, 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления и микроколодцы культуры пластины. Оба достигают эффективной модуляции экспрессии генов и создают человеческие псевдоизоляторы, совместимые для оценки вниз по течению, включая статическое инкубацию и перифузию.