High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing und Transfektion mit akustischer Nanodispensing-Technologie

Die hier vorgestellte Methode beschreibt detailliert, wie DNA-Plasmidmultiplexing und -transfektion in Säugetierzellen bei hohem Durchsatz mit einem akustischen flüssigen Nanospender in einer 384-Well-Platte durchgeführt werden kann, selbst für Nicht-Spezialisten auf diesem Gebiet. Diese kürzlich veröffentlichte Methode¹ ermöglicht die Durchführung von bis zu 384 unabhängigen Plasmid-DNA-Multiplex- und Transfektionsbedingungen in einem Experiment in weniger als 1 h. Einzel- oder Kotransfektionsexperimente waren erfolgreich und erreichten fast 100 % Kotransfektion innerhalb der Population der transfizierten Zellen. Dieses Protokoll erleichtert die Transfektion, da die meisten mühsamen, zeitaufwändigen und fehleranfälligen Schritte jetzt softwaregesteuert sind (eine allgemeine Übersicht siehe Abbildung 1). Es wurden weitere Anstrengungen unternommen, um spezielle Instrumente zu entwickeln, um die Benutzerfreundlichkeit zu verbessern und menschliche Fehler während des gesamten Prozesses zu vermeiden und eine erfolgreiche Transfektion auch für Nicht-Spezialisten auf diesem Gebiet zu fördern. Das beschriebene Protokoll enthält eine “benutzerfreundliche” Makrotabelle, die wir entwickelt haben, um 384 unabhängige Transfektionsbedingungen mit Multiplexing-Möglichkeiten von bis zu vier Plasmiden in jedem Brunnen zu verwalten. Das Makro generiert automatisch Vorlagen der Quellplatte(n), um das erwartete DNA-Plasmidvolumen vom Start von Bestandslösungen und die Dateien zu laden, die erforderlich sind, um die Nanodispenser-Software nach dem eingegebenen experimentellen Design anzutreiben. Da die manuelle Abgabe von DNA in einer 384-Well-Quellplatte mühsam und fehleranfällig ist, haben wir auch eine spezielle Tablet-basierte Anwendung entwickelt, um den Benutzer zu führen und gleichzeitig dna-Lösung entsprechend der Vorlage zu dosieren.

Abbildung 1: Experimenteller Workflow. Schematische Darstellung des optimalen automatisierten Hochdurchsatz-Reverse-Transfektionsprotokolls (vom experimentellen Design bis zum benutzerdefinierten biologischen Assay). Manuelle Schritte werden durch das Handsymbol angezeigt und die ungefähre Zeit für jeden Schritt ist in ein rotes Feld geschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Viele zellbasierte Experimente beginnen mit der Plasmid-DNA-Transfektion, und selbst wenn viele dedizierte Reagenzien entwickelt wurden und werden, um die Transfektionseffizienz zu verbessern und/oder das Verfahren zu erleichtern, bleibt noch viel zu tun^{2,3 , 4}. DNA-Plasmid-Zell-Transfektion umfasst mehrere Schritte, um eine hohe Effizienz zu erreichen, wie eine anfängliche komplexe Aufnahme, endosomale Flucht und zytoplasmatischen Transport zum Kern^5,6. Neben Kalziumfällung oder physikalischen Techniken wie Elektroporation oder Mikroinjektion mit speziellen Geräten⁷haben sich moderne chemische Methoden auf die Verbesserung der DNA-Zell-Entbindung konzentriert und gleichzeitig die Zellzytoxizität^{gesenkt 8, 9}. Die Verwendung von Lipiden oder kationischen Polymeren, die liposomeähnliche Komplexe bilden, und in jüngerer Zeit nichtliposomaler polymerer Chemiesysteme hat die Transfektion einfacher und effizienter gemacht¹⁰. Trotz dieser Entwicklungen erfordert die Zelltransfektion immer noch spezifische Fähigkeiten, die genau ausgeführt werden müssen, da die meisten dieser physikalischen oder chemischen Transfektionsprotokolle von Wissenschaftlern verlangen, jeden DNA-Transfektionsreaktionszustand manuell vorzubereiten. den Durchsatz zu beeinträchtigen. Um dieses Problem zu umgehen, wurden Reverse-Transfektionsprotokolle mit chemischen Transfektionsreagenzien^11,12,13entwickelt, die es dem Anwender ermöglichen, mehrere Plasmide schneller zu testen oder zu kombinieren. In diesen Protokollen werden Nukleinsäurekomplexe mit Transfektionsreagenzien gebildet, bevor die Zellen auf den Komplexen gesät werden. Diese Reverse-Protokolle sind jedoch nach wie vor durch den manuellen Umgang mit DNA-Lösungen und durch die Kombination der einzelnen unabhängigen Bedingungen begrenzt. Obwohl es machbar ist, sie in einem 96-Well-Plattenformat durchzuführen, wird die DNA-Vorbereitung und die Abgabe mühsam sein, und es wird wahrscheinlich Fehler geben. Wenn unterschiedliche Mengen von mehreren DNA-Plasmiden erforderlich und miteinander multiplexiert werden, wird die Zelltransfektion noch schwieriger zu erreichen und zeitaufwändiger, und menschliche Fehler werden unvermeidlich. Die Skalierung auf das 384-Well-Plattenformat in einem umgekehrten Transfektionsansatz wird trotz weniger multiplexierter DNA-Transfektionsbedingungen aus folgenden Gründen zu einer unmöglichen Herausforderung. i) Die zu verwaltenden DNA-Mengen, Transfektionsreagenz oder Reaktionsgemischvolumina sind für jeden Brunnen weniger als 1 L. ii) Das Multiplexing von Plasmiden für 384 unabhängige Erkrankungen wird extrem kompliziert. Die Lieferung in jeder der 384 Brunnen ist auch iii) sehr zeitaufwändig und iv) fehleranfällig. Tatsächlich ist es schwierig, die richtige Lösung in den erwarteten Brunnen zu verteilen, da die bereits ausgegebenen geringen Volumina keine visuelle Überwachung zwischen den leeren und bereits gefüllten Brunnen ermöglichen. v) Schließlich besteht ein hohes Risiko, das Gemisch durch Verdunstung zu trocknen, bevor die Zellen hinzugefügt werden, da die für die Durchführung der erforderlichen Dosierschritte erforderlichen Zeit benötigt wird. Zusammenfassend scheint der begrenzende Faktor für die Einrichtung von DNA-Plasmid-Transfektions-Assays mit hohem Durchsatz die Miniaturisierung des Assays zu sein, was ein Low-Volume-Multiplexing und -Management impliziert, das nicht mehr manuell behandelt werden kann, aber auch in einem zuverlässigen Weg durch klassische peristatische Flüssigkeitshandler.

Als Beweis für die Schwierigkeit, solche Tests zu automatisieren und einen hohen Durchsatz zu erzielen, wurden bisher nur wenige Versuche zur Automatisierung der Transfektion veröffentlicht: ein 96-Well-Plattenformat mit einem kommerziellen Flüssigkeitshandhabungsgerät und Calciumphosphatniederschlag¹⁴ und in jüngerer Zeit ein Lipoplex-Reagenz und ein mikrofluidischer Chip, der 280 unabhängige Transfektionen¹⁵ ermöglicht, aber spezielle Fähigkeiten in diesem Bereich erfordert. Eine andere Methode, die Acoustophorese, die eine Flüssigkeitsschwebe ermöglicht und zu Flüssigkeitsmanipulation und -mischung führt, wurde verwendet, um DNA-Transfektion in 24- bis 96-Well-Plattenformaten¹⁶durchzuführen. Obwohl dieser Ansatz machbar ist, leidet er unter einem extrem niedrigen Durchsatz, da das Mischen von Zellen mit DNA-Transfektionsgemisch eine Inkubation von 60 s für jeden einzelnen Punkt vor der Aussaat erfordert. Dies bedeutet eine Dauer von mindestens 96 min für eine komplette 96-Well-Platte. Darüber hinaus ist dieses Protokoll weit davon entfernt, dem Publikum der Biologen zugänglich zu sein, da diese Arbeit mit einem eigens entwickelten und hergestellten Gerät durchgeführt wurde, das derzeit nicht auf dem Markt erhältlich ist. Im Gegenteil, in den letzten Jahren ist mit Nanovolumen-Dispenser-Geräten eine einfach zu bedienende softwaregesteuerte akustische Dosiertechnologie entstanden. Mit fokussierter akustischer Energie ermöglichen diese Geräte den streng kontrollierten Auswurf kleiner Flüssigkeitsvolumina von 2,5 nL bis 500 nL von einer Quellplatte zu einem Ziel¹⁷. Diese Technologie, die als akustischer Tröpfchenauswurf (ADE) bezeichnet wird, hat zahlreiche Vorteile: Sie ist vollautomatisiert, berührungslos, spitzenlos, präzise, präzise und hoch reproduzierbar und hat einen hohen Durchsatz^{von 18}. Zuerst für die Lieferung von Dimethylsulfoxid (DMSO) Lösungen gewidmet, wurden die Einstellungen verbessert, um wässrige Puffer zu verteilen¹⁹. Akustische Nanospender scheinen daher für Reverse-Zell-Transfektionsprotokolle geeignet zu sein und könnten die meisten der oben genannten manuellen Einschränkungen umgehen. Da bisher keine Plasmidtransfektionsversuche mit dieser Technologie beschrieben wurden, haben wir kürzlich die Eignung eines akustischen Dosiersystems für die Durchführung von Reverse-Zell-Transfektionen bewertet.

Unter Ausnutzung des Nanodispensers-Durchsatzes und der Benutzerfreundlichkeit optimierten wir ein Reverse-Transfektionsprotokoll für HeLa-Zellen, indem wir mehrere Parameter kreuztesten, die die DNA-Transfektion auf einer 384-Well-Einzelplatte beeinflussen können, nämlich die gesamte DNA-Menge und Dna-Ausgangskonzentration, Verdünnungsvolumen, Transfektionsreagenz und Anzahl der Streuzellen. Das entwickelte Protokoll umgeht die oben beschriebenen manuellen Einschränkungen der Zelltransfektion und bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen automatisierten Transfektionsversuchen. Erstens wird es miniaturisiert, wodurch ein kostengünstiges Transfektionsreagenz durch Speichern von DNA-Plasmidpräparaten und Transfektionsreagenz ermöglicht wird. Zweitens ist es viel mehr durchsatzfähig und reproduzierbar als das manuelle Protokoll (auch für Anfänger), da die Transfektion einer ganzen 384-Well-Platte in weniger als 1 h erreicht werden kann. Schließlich ist es softwaregesteuert, so dass die Kontrolle der abgegebenen DNA-Menge und die Multiplexing von mehreren Plasmiden. Dank der Nanodispenser-Software (Table of Materials) kann der Anwender einen Studienplan ausarbeiten, um die Volumina zu steuern, die von einer definierten Quellbrunnenplatte zu einem Zielschild abgegeben werden sollen.

Das hier vorgestellte Protokoll richtet sich vor allem an diejenigen, die Zugang zu einem Nanospender haben und Transfektionsexperimente mit hohem Durchsatz einrichten möchten, aber auch für diejenigen, die ihre Transfektionsparameter für einen bestimmten Zelltyp schnell optimieren möchten, Anwendung dieses Protokolls, um mehrere Parameter bei hohem Durchsatz zu kreuztesten. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass optimierte Parameter, die mit diesem nanoskaligen Protokoll identifiziert wurden, auf größere und manuelle Transfektionsexperimente übertragen werden können. Da das im vorliegenden Protokoll verwendete Transfektionsreagenz dna- oder siRNA-Transfektion nach Angaben des Herstellers zulässt, ist das Protokoll auch für diejenigen von Interesse, die Array-Ansätze für Genüberexpression oder Knockdown durchführen wollen. Die mit DNA vorgefüllten Zielplatten können bis zu 7 Tage vor der Anwendung in einem Transfektionstest ohne Wirksamkeitsverlust konserviert werden, was ein weiterer Vorteil des folgenden Protokolls für diese Art der Anwendung ist.