二次细菌性肺炎的鼠种模型的精确病原体输送与恢复系统

所有方法均符合国家卫生研究院的准则，并经蒙大拿州立大学动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准。 1. 内切内灌输 准备一个包含以下用品的工作空间：插管平台、无菌 1 mL 注射器、无菌钝尖钳、无菌 21 度钝尖针和两个圆锥管来存放注射器和钳子。注：插管平台可以商业购买或内部建造。此处使用的插管平台使用 0.25 英寸有机玻璃构建。简单地说，加热施加到有机玻璃上，电路板弯曲到大约65°内部角度。在插管平台的外侧，两个机器螺钉被播种3英寸，两个螺钉之间悬挂了一个橡皮筋。 通过连续稀释样品来制备病原体接种，以便获得所需的最终浓度，总体积为50μL。 戴上无菌手套，将 21 G 钝尖针弯曲至约 35°。注：每只鼠标都需要单独的针头。 将弯曲的 21 G 钝尖针头固定在 1 mL 注射器上。将100μL气垫放入注射器中，然后加入50μL的传染性剂。将装载的针头和注射器放在一个便于主手接近的位置。 使用4%异苯可勒/氧混合物或类似的IACUC批准的麻醉方法对小鼠进行深度麻醉。当呼吸速度减慢到大约每 5–8 s 1 次吸入时，通常会获得适当的麻醉深度，并且可以通过捏住附物和观察小鼠没有反应来确认。注：这种麻醉方法提供了大约1.5分钟的麻醉时间。这足以让我们实验室的成员学习并执行此灌输过程;然而，其他机构批准的麻醉方法可以采用11，12，13。 从麻醉室中取出麻醉小鼠，并将鼠标从上颌切口器上悬挂在插管平台上。 要打开进入气管的清晰通道，请使用钝尖钳轻轻抓住并伸出嘴外的舌头。将舌头从钳子转移到非主导手的拇指和食指。 保持舌头在非主导手，拿起预装注射器。将针的弯曲端指向远离身体的地方，然后将针头插入口腔到舌头底部。 用针头放在舌头底部，轻轻将手腕角度，使针头稍微推离身体。此步骤确保针头将插入气管，而不是食道。 慢慢地将针头引导到气管中;当针穿过声带时，通常会有轻微的滴答声。通过气管的针头，直到针遇到卡林纳时感觉到轻微的阻力。 稍微抬起近端方向的针，将针头悬挂在卡林纳上方。这使得交付到两个主支气管。完全按下注射器的柱塞，以提供传染性负载。向上抬起并丢弃，将针头从气管中取出。 通过按下橡皮筋将鼠标从插管平台中取出，但保持将鼠标保持直立姿势。将手指直接放在鼻腔上，从而阻塞鼻腔。保持此位置约 1 分钟或直到观察到几次深呼吸。注：最后一步确保总接种量传递到下呼吸道。 将鼠标返回到笼子，观察麻醉后完全恢复。 2. 感染肺的切除 在层压流罩内工作以保持无菌性，准备一个包含以下物品的工作空间：秤和无菌称重船、解剖平台、包含剪刀和钳子的解剖套件、无菌 RNA 无 RNAE PBS 和无菌纱布。 使用CO2或类似的IACUC批准的安乐死方法对受感染的小鼠实施安乐死。 将受感染的鼠标放在解剖平台上，并使用每个附属项末端的针脚固定鼠标。用乙醇喷洒鼠标，以帮助保持工作表面的不无菌性。 从脐带开始，用一对钳子抬起皮肤，切开气管底部。抓住初始切口两侧的皮肤，将皮肤从身体中拉出，并穿过组织连接。注：在皮肤上进行几次横向切割，以揭示更多的胸腔区域，会很有帮助。 从西佛化过程的基础开始，做一个小切口，意图刺穿膜片。这导致胸腔压力增加，导致肺部缩回。随着肺缩回继续切口，以释放隔膜。 沿着肋笼的两侧切开肋骨。这将完全暴露胸腔和肺部。 要切除肺部，用钳子抓住心脏底部，向上抬起。将剪刀放在肺后面，开始通过组织连接进行小切口，同时继续向上抬起心脏。 一旦肺部被切除，将它们放在无菌纱布上，并取出心脏。心脏可以通过用钳子将其从肺部提起并切断剩余的组织连接来轻松去除。 将肺转移到预量称重船并记录重量。 在肺被称重后，将它们转移到无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并暂时将它们储存在冰上，直到进入病原体的恢复和分析步骤。 3. 病原体恢复与分析 继续在层流罩内工作，准备一个工作空间，提供以下耗材：组织研磨机、无菌RNA无氧PBS、缓冲液RLT辅以β-甲苯乙醇（1：100）和1.5 mL RNAE无微离心管。注意：在皮肤接触、摄入、眼睛接触或吸入的情况下，β-甲壳乙醇可能很危险。在烟气罩中应将β-甲酮乙醇稀释到缓冲液RLT中。 首先，在组织研磨机中加入1 mL无菌RNA无核酶PBS。填充后，将组织研磨机存放在冰上。 准备一系列无菌RNA酶无连续稀释管，用于量化从受感染肺部恢复的细菌负荷。这是最容易实现的，将900μL的无菌水分到每个微离心管中，然后连续稀释病原体接种。注：准确病原体枚举所需的稀释管数量在初始病原体输入和感染持续时间上会有所不同。这必须经过经验确定。 使用无菌钳子，将肺转移到准备好的组织研磨机中，并在旋转时按下底座，使组织完全均匀化。 将组织研磨机和等质样品的等分 100 μL 开到制备的串行稀释管中。通过电镀到营养琼脂上，连续稀释样品并枚举CCF。CCF 可记录为 CCF/mL 或 CCF/mL/mg 肺组织。注：在此步骤中，可去除另外200 μL的均质样品，用于纯化病毒RNA（参见材料表），或储存在-80°C下，以供将来分析。 在去除等分物以进行CFU测定和/或病毒RNA分离后，在4°C下以4，000rpm（3724 x g）离心10分钟，将研磨底座和颗粒均匀化组织进行颗粒。 使用移液器，从颗粒样品中取出上清液，放入 1.5 mL 微离心管中。注：上清液不含细菌，可储存在-80°C，用于分析可溶性宿主和分泌病原体因素。 通过在700 μL缓冲液RLT-α-mercaptoethanol中移液或涡流重新悬浮均质组织颗粒，并将样品转移到无菌无RNA酶的1.5 mL微离心管中。注：此时样品可在-80°C下储存数月。 纯RNA，对制造商的纯化试剂盒协议稍作修改（见材料表）;见沃伊奇等人2008年14。 将均质肺浆液转移到含有 0.1 mm 硅珠的 2 mL 微离心管中，并在 6 m/s 下通过珠搅拌器处理 20 s。 在 1，500 rpm 转速下将样品离心 3 分钟。离心后，将上液液液液液放入新的1.5 mL微离心管中。 将 350 μL 的 96%-100% 乙醇加入样品中，并通过移液或倒置彻底混合。 将700 μL样品转移到放置在2 mL收集管中的纯化柱中。将样品在 ±8，000 x g下离心 15 s，并丢弃流过。通过上述列运行任何多余的样本。 用700 μL缓冲RW1和离心样品以±8，000 x g清洗柱15s。丢弃流过，将硅膜柱转移到新的2 mL收集管中。 将 500 μL 的缓冲 RPE 应用于列。以 ± 8，000 x g的离心清洗柱 15 s。丢弃流过。 在 8，000 x g下将额外的 500 μL 缓冲 RPE 施加到 RNeasy 柱和离心机 2 分钟。 丢弃流通，并在 ±10，000 x g下离心 1 分钟。 要洗脱纯化的RNA，首先将柱转移到新的1.5 mL无RNA酶微离心管。将50μL无RNase水直接输送到柱的硅胶膜上，以±8000 x g离心1分钟。注：洗脱的RNA可以再次运行在同一列上，以增加RNA的产量。 向纯化RNA中加入50μL无RN酶水，使总体积达到100μL。 将样品涂在收集管中的净化柱上，以±8000 x g的离心放置15s。丢弃流过，更换收集管。 通过添加 350 μL 的缓冲 RW1，然后以 ±8000 x g离心 15 s 来洗涤柱。 通过将 10 μL 的 DNase 库存 （750 Kunitz 单位/mL） 添加到 70 μL 的缓冲 RDD 中，制备包含约 27 个 Kunitz 单位的 DNase 溶液。将80μL的DNase溶液直接加入硅胶膜，并在室温下孵育样品15分钟。 用350 μL缓冲RW1清洗柱子，用±8000 x g清洗离心机15s，然后丢弃流过。 重复步骤 3.9.6~3.9.8 来纯化RNA。注： 建议按照步骤 3.9.9*3.9.10 和 3.9.6*3.9.8（跳过 DNase 步骤 3.9.11–3.9.13）重复 RNA 清理程序。这种额外的清理结果产生非常高质量的RNA。 RNA产量可以使用分光光度计进行量化，其读数为260 nM，纯度为260：280 nM。获得RNA产量后，将每个RNA样品的浓度标准化为50纳克/μL。注：建议在浓度为50纳克/μL时制造多个等分，以避免导致RNA降解的冻结/解冻循环。 将纯化RNA储存在-80°C或立即用于抄本分析。注：在以前的出版物中，3-5只小鼠的RNA被汇集到进行抄本分析。通过优化上述技术，从1只小鼠的RNA被经验确定足以进行转录分析（80×120纳克/μL）。