二次細菌性肺炎のマウスモデルに対する精密病原体送達と回復システム

すべての方法は、国立衛生研究所のガイドラインに準拠し、モンタナ州立大学の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。 1. 気管内刺激 次の消耗品を含むワークスペースを準備する:挿管プラットホーム、無菌1 mLシリンジ、無菌の鈍い先端の鉗子、無菌の21ゲージの鈍い先端の針および注射器および鉗子を貯えるために2つの円錐形の管。注:挿管プラットフォームは、商業的に購入することも、社内で構築することもできます。ここで使用される挿管プラットホームは0.25インチプレキシガラスを使用して組み立てられた。簡単に言えば、プレキシガラスに熱を加え、ボードは約65°の内部角度に曲がっています。挿管プラットフォームの外側には、2本の機械ネジが3インチ離れて播種され、2本のネジの間にゴムバンドが吊り下げられました。 目的の最終濃度が50μLの総体積で得られるようにサンプルを連続的に希釈して病原体接種を準備する。 滅菌手袋を着用し、21Gの鈍い先端の針を約35°に曲げます。注:マウスごとに別々の針が必要です。 曲がった21Gの鈍い先端の針を1 mLの注射器に固定します。100 μL のエアクッションを注射器に引き込み、続いて感染剤の 50 μL を引き出します。荷を積んだ針と注射器を、支配的な手で簡単にアクセスできる場所に置きます。 4%イソフルラン/酸素混合物または同様のIACUC承認された麻酔法を用いてマウスを深く麻酔する。適切な麻酔深さは、呼吸速度が5〜8sあたり約1吸入に遅い場合に通常得られ、付属品をつまみ、マウスからの反応を観察することによって確認することができる。注:麻酔のこの方法は、約1.5分の十分な麻酔期間を提供しました。これは、私たちの研究室のメンバーがこのインスティレーション手順を学び、実行するのに十分でした。しかしながら、他の制度的に承認された麻酔法は、11、12、13を採用してもよい。 麻酔室から麻酔マウスを取り出し、上顎切開から挿管プラットフォーム上のマウスを中断します。 気管に明確な通路を開くために、鈍い先端の鉗子を使用して、口の外側の舌を穏やかにつかみ、伸ばします。鉗子から非支配的な手の親指と人差し指に舌を移します。 非支配的な手で舌を保持し、プリロードされた注射器を拾います。針の曲がった端を体から離し、口腔に針を舌の基部に挿入します。 舌の付け根に針を付けて、手首をそっと角度を付けて、針を体から少し押し出します。このステップは針が食道ではなく気管に挿入されることを保証する。 ゆっくりと気管に針を導きます。多くの場合、針が声の折り目を通過するようにわずかなダニが感じられます。針がカリーナに遭遇するにつれてわずかな抵抗が感じられるまで、気管を通して針を渡します。 わずかに近位方向に針を持ち上げて、カリーナの上に針を吊り下げます。これは2つの主要な気管支への配達を可能にする。注射器のプランジャーを完全に押し下して、感染負荷を引き出します。気管から針を上に持ち上げて取り出し、捨てます。 ゴムバンドを押し下げて挿管プラットフォームからマウスを取り外しますが、マウスを直立した位置に保持したままにします。鼻の上に直接指を置くことによって鼻気道を妨害する。約1分間、またはいくつかの深い呼吸が観察されるまで、この位置を保持します。注:この最後のステップは、合計接種体積が下気道に送達されることを保証する。 マウスをケージに戻し、麻酔からの完全な回復を観察します。 2. 感染した肺の切除 無菌性を維持するために層流フード内で働き、スケールおよび無菌の重量を量るボート、解剖プラットホーム、はさみおよび鉗子を含む解剖キット、無菌のRNAE自由なPBSおよび無菌ガーゼとのワークスペースを準備する。 感染したマウスをCO2または類似のIACUC承認済み安楽死法で安楽死させる。 感染したマウスを解剖プラットフォームに置き、各付属品の最後にピンを使用してマウスを固定します。作業面の無菌性を維持するためにエタノールでマウスをスプレーします。 臍から始まり、一対の鉗子を使用して皮膚を持ち上げ、気管の基部まで切開する。最初の切開の両側の皮膚をつかみ、皮膚を体から引き離し、組織の接続を切断する。注:胸部領域の多くを明らかにするために、皮膚全体にいくつかの横切りを行うことができると便利です。 xiphoid プロセスの基部から始まり、横隔膜を穿刺する意図で小さな切開を行います。これは、肺を後退させる胸腔内の圧力の増加をもたらす。肺を引き込んで、横隔膜を解放するために切開を続ける。 肋骨ケージの両側に沿って切開を行い、肋骨を取り除きます。これは完全に胸腔および肺を露出させる。 肺を取り除くために、鉗子で心臓の基部をつかみ、上に持ち上げます。肺の後ろにはさみを置き、心臓を上に持ち上げ続けながら、組織の接続を介して小さな切開を開始します。 肺を摘出したら、無菌ガーゼの上に置き、心臓を取り除きます。心臓は鉗子で肺から離れて持ち上げ、残りの組織の接続を切断することによって容易に取除くことができる。 肺をタール前の計量ボートに移し、重量を記録する。 肺の計量後、無菌リン酸緩衝生理食生(PBS)に移し、病原体の回収と分析のステップに進むまで一時的に氷の上に保存します。 3. 病原体の回収と分析 層流フード内で作業を続け、次の消耗品でワークスペースを準備します:組織粉砕機、無菌RNAseフリーPBS、β-メルカプトエタノール(1:100)を補充したバッファRLT、および1.5 mL RNAEフリーマイクロセントリファージチューブ。注意:β-メルカプトエタノールは、皮膚接触、摂取、眼接触、または吸入の場合に危険な場合があります。緩衝RLTへのβ-メルカプトエタノールの希釈は、ヒュームフードで行われるべきである。 まず、無菌RNAseフリーPBSを1mLの菌組織粉砕機に添加します。充填したら、ティッシュグラインダーを氷の上に保管します。 感染した肺から回収された細菌負荷を定量化するために使用される一連の無菌RNAEフリーシリアル希釈管を準備します。これは、各マイクロ遠心管に900μLの滅菌水をアリコートし、続いて病原体の接種をシリアル希釈することによって最も容易に達成される。注:正確な病原体の列挙に必要な希釈管の数は、初期病原体の入力と感染期間によって異なります。これは経験的に決定されなければなりません。 滅菌鉗子を使用して、準備されたティッシュ粉砕機に肺を移し、回転しながら台座を押すことによって組織を完全に均質化する。 均質化されたサンプルの組織粉砕機とアリコート100 μLを、調製されたシリアル希釈チューブの最初に開きます。サンプルを連続的に希釈し、栄養寒天にメッキを施すことでCUを列挙します。CFOは、肺組織のCFO/mLまたはCFC/mL/mgとして記録することができる。注:このステップでは、ウイルスRNAの精製のために均質化されたサンプルの追加の200 μLを除去するか(材料の表を参照)、または将来の分析のために-80°Cで保存することができます。 CFU判定および/またはウイルスRNA単離のためにアリコートを除去した後、4,000 rpm(3724 x g)で遠心分離により粉砕台座とペレットを4°Cで10分間遠心分離して置き換えます。 ピペットを使用して、ペレットサンプルから上清を取り出し、1.5mLのマイクロ遠心管に入れます。注:上清は細菌を含んでおらず、可溶性宿主および分泌された病原体因子の分析のために-80 °Cで貯えることができる。 700 μLの緩衝液RLT-mercaptoethanolでピペッティングまたはボルテックスにより均質化された組織ペレットを再懸濁し、無菌のRNAseフリー1.5mLマイクロ遠心分離管にサンプルを移します。注:この時点でサンプルは数ヶ月間-80 °Cで貯えることができる。 精製キットのメーカーのプロトコルにわずかな変更を使用してRNAを精製する(材料の表を参照)。Voyich et al. 200814を参照してください。 均質化された肺スラリーを0.1mmのシリカビーズを含む2mLマイクロ遠心管に移し、6m/sで20秒のビーズビーターで処理します。 サンプルを1,500 rpmで3分間遠心分離します。遠心分離後、上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心管にピペットします。 サンプルに96%~100%エタノールの350μLを加え、ピペッティングまたは反転によって完全に混合します。 試料の700μLを2mL回収管に入れた精製カラムに移します。15 s の場合は ≥8,000 x gでサンプルを遠心分離し、フロースルーを破棄します。上記と同じ列を使用して、余分なサンプルを実行します。 700 μL のバッファー RW1 と遠心分離機サンプルを 15 s の ≥ 8,000 x gでカラムを洗浄し、シリカ膜カラムを新しい 2 mL 回収チューブに移します。 500 μL のバッファ RPE をカラムに適用します。15 s. フロースルーを破棄する ≥ 8,000 x gで遠心分離でカラムを洗います。 RNeasy カラムにさらに 500 μL のバッファ RPE を適用し、8,000 x gで 2 分間フロースルーを破棄し、1 分間 ≥10,000 x gでカラムを遠心分離します。 精製RNAを溶出させるには、まずカラムを新しい1.5mL RNAEフリーマイクロ遠心分離管に移します。カラムのシリカゲル膜に直接トルナスフリー水のピペット50 μLを、1分間≥8000 x gで遠心分離機に直接入れます。注: ELuted RNA を同じカラム上で再度実行して、RNA 歩留まりを高めることができます。 精製されたRNAに50 μLのRNaseフリー水を加え、総体積を100 μLにするアリコット350 μL RLT-θ-メルカプトエタノールに続いて、96%~100%エタノールの250 μLをサンプルに加え、ピペッティングまたは反転によって完全に混合します。 サンプルをコレクションチューブに置き、遠心分離機を ≥8000 x gで 15 s. フロースルーを破棄し、コレクションチューブを交換します。 350 μL のバッファー RW1 を追加し、その後 15 s の ≥8000 x gで遠心分離を加えてカラムを洗浄します。 10 μL の DNase ストック (750 クニッツ単位/mL) をバッファー RDD の 70 μL に加えることで、約 27 クニッツ単位を含む DNase ソリューションを調べります。80 μLのDNase溶液をシリカゲル膜に直接加え、室温で15分間インキュベートします。 350 μL のバッファー RW1 と遠心分離機でカラムを 15 s の ≥8000 x gで洗浄し、フロースルーを破棄します。 RNA を精製するには、手順 3.9.6 ~ 3.9.8 を繰り返します。注: 3.9.9~ 3.9.10 および 3.9.6 ~ 3.9.8 (DNase ステップ 3.9.11~ 3.9.13 をスキップ) に従って、RNA クリーンアップ手順を繰り返すことをお勧めします。この追加のクリーンアップは、非常に高品質のRNAをもたらします。 RNA歩留まりは、濃度を決定するための260 nMの測定値と純度のための260:280 nMの分光光度計を使用して定量することができます。RNA収率を得た後、各RNAサンプルの濃度を50ng/μLに標準化します。注:RNAの劣化につながる凍結/解凍サイクルを避けるために、50 ng/μLの濃度で複数のアリコートを作ることをお勧めします。 精製したRNAを-80°Cに保存するか、直ちに転写分析に使用してください。注:以前の出版物では、3~5匹のマウスからのRNAを転写物分析のためにプールした。上記の技術の最適化を通じて、1匹のマウスからのRNAは、転写分析(80-120 ng/μL)に十分であると経験的に決定された。