משלוח הפתוגן מדויק מערכת השחזור של מודלים Murine של דלקת ריאות משנית בקטריאלי

כל השיטות תואמות את ההנחיות הלאומיות לבריאות ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) באוניברסיטת מדינת מונטנה. 1. האינטרוסטציה הכן מרחב עבודה המכיל את האספקה הבאה: פלטפורמת צנרור, מזרק מעוקר 1 מ”ל, סטרילי מלקחיים בוטה קהה, סטרילי 21-מד מחט קהה, ושני צינורות חרוט לאחסן את המזרק ואת מלקחיים.הערה: ניתן לרכוש פלטפורמות צנרור באופן מסחרי או מוקם בתוך הבית. פלטפורמת הצנרור המשמשת כאן נבנתה באמצעות 0.25 אינץ ‘ פלקסיגלס. בקצרה, החום הוחל על פלקסיגלס והלוח מכופף זווית הפנים משוער 65 °. בצד החיצוני של פלטפורמת הצנרור, שני בורגי מכונה הופרה בהפרש של 3 סנטימטרים ולהקת גומי הושהתה בין שני הברגים. הכינו את הפתוגן על ידי מדלל באופן סדרתי את המדגם כך הריכוז הסופי הרצוי מתקבל בנפח כולל של 50 μL. Store את האינוות על הקרח. לבישת כפפות סטרילי, לכופף 21 G בוטה משופעת מחט ל כ 35 °.הערה: יש צורך במחט נפרדת עבור כל עכבר. לתקן את המחט 21 גרם בוטה קהה מזרק 1 מ ל. צייר 100 μL כרית אוויר לתוך המזרק ואחריו 50 μL של הסוכן הזיהומיות. הניחו את המחט והמזרק שנטענו במקום נגישים בקלות בידי היד הדומיננטית. באופן עמוק מורדם עכבר באמצעות 4% isofלבנה/חמצן תערובת או דומה IACUC מאושר שיטה של הרדמה. עומק הרדמה נכונה מושגת בדרך כלל כאשר קצב הנשימה איטי כ 1 שאיפת לכל 5 – 8 s והוא יכול להיות מאושר על ידי צובט הנספח והתבוננות לא תגובה מהעכבר.הערה: שיטה זו של הרדמה סיפקה משך ההרדמה מספיק של כ 1.5 דקות. זה היה מספיק לחברים במעבדה שלנו כדי ללמוד ולבצע את הליך ההחדרה; עם זאת, ניתן לעשות שיטות הרדמה אחרות שאושרו ב-11,12,13. להסיר את העכבר מורדם מחדר ההרדמה ולהשעות את העכבר על פלטפורמת צנרור מן חותכות הלסת מלאה. כדי לפתוח מעבר ברור לתוך קנה הנשימה, להשתמש מלקחיים בוטה משופעת לתפוס בעדינות למתוח את הלשון מחוץ לתוך הפה. העבירו את הלשון מהלקחיים לתוך האגודל והאצבע המורה של היד הלא-דומיננטית. הישארו מחזיקים את הלשון ביד הלא שלטת והרימו את המזרק שנטען מראש. הצבע את הקצה העקום של המחט הרחק מן הגוף ולהכניס את המחט לתוך חלל הפה לבסיס הלשון. עם המחט בבסיס הלשון, בעדינות זווית היד כדי לגרום דחיפה קלה של המחט הרחק מן הגוף. צעד זה מבודד את המחט יוכנס לקנה הנשימה ולא הוושט. לאט להנחות את המחט למטה לתוך קנה הנשימה; לעתים קרובות שנתות קל מרגיש כמו המחט עובר דרך קיפול הקול. להעביר את המחט דרך קנה הנשימה עד התנגדות קלה הוא הרגיש כמו המחט נתקלת הקרינה. מרימים מעט את המחט בכיוון הגבוה ביותר כדי להשעות את המחט מעל הקרינה. הדבר מאפשר מסירה לשני הברוצ הראשי. לדכא לחלוטין את הבוכנה של המזרק כדי לספק את העומס הזיהומיות. הסר את המחט מקנה הנשימה על ידי הרמת כלפי מעלה ולהשליך. להסיר את העכבר מפלטפורמת צנרור ידי מדכא את הלהקה גומי אבל לשמור על החזקת העכבר בתנוחה זקופה. לחסום את דרכי הנשימה של האף על ידי הצבת אצבע ישירות מעל nares. החזיקו עמדה זו למשך כ 1 דקות או עד כמה נשימות עמוקות מתבוננים.הערה: השלב האחרון מבטיח שעוצמת הקול הכוללת תימסר למערכת הנשימה התחתונה. להחזיר את העכבר לכלוב שלו ולהתבונן התאוששות מלאה מן ההרדמה. 2. כריתה של הריאות נגוע עבודה בתוך מכסה הזרימה לשימור כדי לשמור על עקרות, להכין סביבת עבודה עם הפריטים הבאים: קנה מידה וסירה שוקל סטרילי, פלטפורמת חיתוך, ערכת ניתוח המכיל מספריים ומלקחיים, מעוקר RNAse-PBS חינם, ו גזה סטרילית. המתת חסד עכבר נגוע עם CO2 או דומה IACUC מאושר שיטת המתת חסד. מניחים עכבר נגוע על פלטפורמת לחיתוך ולאבטח את העכבר באמצעות פינים בסוף כל תוספת. לרסס את העכבר עם אתנול כדי לעזור לשמור על עקרות של משטחי עבודה. החל על הטבור, השתמש זוג מלקחיים להרים את העור ולעשות חתך לבסיס של קנה הנשימה. אוחז את העור משני צדדיו של החתך הראשוני, למשוך את העור הרחק מהגוף וחותכים את הקשרים רקמות.הערה: זה יכול להיות שימושי לעשות כמה חתכים לרוחב על פני העור כדי לחשוף יותר של אזור החזה. החל בבסיס התהליך, הפוך את החתך הקטן בכוונה לתוך הסרעפת. התוצאה היא עלייה בלחץ בחלל החזה הגורמת הריאות לסגת. עם הריאות ושוב להמשיך את החתך כדי לשחרר את הסרעפת. להסיר את הצלעות על ידי ביצוע חתך לאורך שני צידי כלוב הצלעות. זה יחשוף לחלוטין את. חלל החזה והריאות כדי לבלו את הריאות, אחוז בבסיס הלב עם הלקחיים והרם כלפי מעלה. הניחו את המספריים מאחורי הריאות והתחילו לעשות חתכים קטנים דרך הרקמה בזמן שממשיכים להרים את הלב כלפי מעלה. מניחים אותם על הגזה. הסטרילית ומסירים את הלב הלב ניתן להסיר בקלות על ידי הסרתו מן הריאות עם מלקחיים לחתוך את החיבורים הנותרים רקמות. העבירו את הריאות לסירה שוקלת. מראש והקליטו את המשקל לאחר הריאות שקלו, להעביר אותם מלוחים סטרילית מאגר פוספט (PBS) ולאחסן אותם באופן זמני על הקרח עד לנוע קדימה התאוששות הפתוגן ושלבי ניתוח. 3. שחזור וניתוח הפתוגן המשך לעבוד בתוך כיסוי הזרימה למינארי, להכין את סביבת העבודה עם האספקה הבאה: מטחנת רקמות, מעקר RNAse-PBS חינם, מאגר RLT שיושלם עם למשל-mercaptoethanol (1:100), ו 1.5 mL RNAse-מיקרוצנטריפוגה חינם צינורות.התראה: במקרה של מגע העור, בליעה, קשר עין או אינהלציה. דילול של מרסטואתנול לתוך מאגר RLT צריך להיעשות בתוך מכסה. להתחיל על ידי הוספת הראשון 1 מ ל של הPBS סטרילי RNAse-חינם אל מטחנת הרקמה. . ברגע שתמלא, אחסן את מטחנת הרקמה על הקרח הכן סדרה של צינורות דילול RNAse-חינם סדרתי שישמשו לכמת את העומס חיידקי התאושש הריאות הנגוע. זה מושגת בקלות ביותר על ידי מצטט 900 μL של מים סטריליים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה כל ואחריו על ידי דילול סדרתי של הפתוגן.הערה: מספר צינורות הדילול הנחוצים לספירת פתוגן מדויקת ישתנו בכניסת הפתוגן הראשונית ובמשך ההדבקה. . זה חייב להיקבע באמצעות מדעית באמצעות מלקחיים סטרילי, להעביר את הריאות לתוך מטחנת הרקמה המוכן והמגון ביסודיות את הרקמה על ידי לחיצה על המעמד בעת סיבוב. פתח את מטחנת הרקמה סדרת מחלקים 100 μl של המדגם המתכלה לתוך הראשון של צינורות הדילול הסדרתי המוכנים. מדלל את הדגימות ומספור את הדפוס באמצעות ציפוי על אגר מזינים. ניתן להקליט את הקפוס כ-CFUs/mL או בדפוס/מ מ/mg של רקמת הריאה.הערה: בשלב זה 200 μL נוספים של דגימת הומוגניים ניתן להסיר לטיהור של רנ א נגיפי (ראה טבלת חומרים) או מאוחסן ב-80 ° c לניתוח עתידי. לאחר ההסרה הוסרו לקביעת CFU ו/או ויראלי בידוד RNA, להחליף את המעמד שחיקה ואת הגלולה הומוגניים הרקמה ידי צנטריפוגה ב 4,000 rpm (3724 x g) עבור 10 דקות ב 4 ° c. באמצעות פיפטה, להסיר את supernatant מתוך דגימת המקום ומקום לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.הערה: סופרנטנט הוא ללא חיידקים וניתן לאחסנו ב-80 ° c לניתוח של גורמי הפתוגן מסיסים ומופרשים. השהה מחדש את הרקמה המנשבת על-ידי ליטוף או vortexing ב-700 μL של מאגר RLT-, מרקוטואתנול והעבר את הדגימה לשפופרת סטרילית RNAse-1.5 free mL מיקרוצנטריפוגה.הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את הדגימות ב-80 ° c במשך מספר חודשים. טיהור RNA באמצעות שינויים קלים בפרוטוקול היצרן של ערכת טיהור (ראה טבלת חומרים); ראה Voyich et al. 200814. להעביר את המיטר הריאה מוקצב לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 מ”ל המכיל 0.1 מ”מ חרוזי סיליקה ו מעובד באמצעות מקצף חרוז עבור 20 s ב 6 מ מ. צנטריפוגה את המדגם ב 1,500 סל ד למשך 3 דקות. לאחר צנטריפוגה, מנקז את הסופרנטנט לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 mL. הוסף 350 μL של 96% – 100% אתנול למדגם לערבב ביסודיות על ידי ליטוף או היפוך. העבר 700 μL של המדגם לעמודת טיהור הממוקמת בשפופרת אוסף של 2 מ”ל. צנטריפוגה את המדגם ב ≥ 8,000 x g עבור 15 s ולמחוק את הזרימה דרך. הפעל את כל הדגימות העודפות דרך אותה עמודה כפי שתוארה לעיל. לשטוף את העמודה עם 700 μL של מאגר RW1 ומדגם צנטריפוגה ב ≥ 8,000 x g עבור 15 s. למחוק את הזרימה-דרך ולהעביר את הטור קרום סיליקה לתוך צינור חדש 2 mL האוסף. החל את 500 μL של מאגר RPE לעמודה. לשטוף את העמודה על ידי צנטריפוגה ב ≥ 8,000 x g עבור 15 s. למחוק את הזרימה. החל נוסף 500 μL של מאגר RPE לעמודה RNeasy וצנטריפוגה ב 8,000 x g עבור 2 דקות. למחוק את זרימת ולצנטריפוגה את העמודה ב-≥ 10,000 x g עבור 1 דקות. כדי לטהר את ה-RNA, התחל בהעברת הטור לשפופרת מיקרוצנטריפוגה חדשה 1.5 mL RNAse. פיפטה 50 μL של RNase-מים ללא תשלום ישירות על ממברנה סיליקה ג’ל של העמודה ואת צנטריפוגה ב ≥ 8000 x g עבור 1 דקות.הערה: ה-RNA החומק יכול להיות מופעל על אותה עמודה שוב כדי להגדיל את התשואה RNA. להוסיף 50 μL של RNase-מים ללא מטוהרים RNA כדי להביא את הנפח הכולל ל 100 μL. Aliquot 350 μL RLT-מרסטואתנול ואחריו 250 μL של 96% – 100% אתנול למדגם ולערבב ביסודיות על ידי ליטוף או היפוך. החל את המדגם על עמודת טיהור ממוקם בצינור אוסף וצנטריפוגה ב ≥ 8000 x g עבור 15 s. למחוק את הזרימה ולהחליף את צינור הגבייה. לשטוף את העמודה על ידי הוספת 350 μL של מאגר RW1 ואחריו צנטריפוגה ב ≥ 8000 x g עבור 15 s. הכנת פתרון DNase המכיל כ 27 יחידות Kunitz ידי הוספת 10 μL של מלאי DNase (750 ביחידות Kunitz/mL) כדי 70 μL של מאגר RDD. הוסף 80 μL של הפתרון DNase ישירות על קרום סיליקה ג’ל ו מודקת את המדגם עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את העמודה עם 350 μL של מאגר RW1 ו צנטריפוגה ב ≥ 8000 x g עבור 15 s ולמחוק את הזרימה דרך. חזור על שלבים 3.9.6 – 3.9.8 לטהר את ה-RNA.הערה: מומלץ לחזור על הליך הניקוי של RNA על-ידי ביצוע השלבים 3.9.9 – 3.9.10 ו 3.9.6 – 3.9.8 (דלג על שלבי DNase 3.9.11 – 3.9.13). זה נוסף לנקות את זה גורם RNA באיכות גבוהה מאוד. תשואה RNA ניתן לכמת באמצעות ספקטרוסקופיה עם קריאות ב 260 nM לקביעת ריכוז 260:280 nM לטוהר. לאחר תשואה RNA מושגת, לתקנן את הריכוז של כל דגם RNA כדי 50 ng/μL.הערה: מומלץ לבצע מספר מחזורי שינה בריכוז של 50 ng/μL כדי למנוע הקפאה/הפשרה של מחזורים שיכולים להוביל לירידה RNA. אחסן את ה-RNA הטהור ב-80 ° צ’ או השתמש באופן מיידי לניתוח תעתיק.הערה: בפרסומים קודמים רנ א מ 3-5 עכברים היתה במאגר עבור ניתוח תעתיק. באמצעות אופטימיזציה של הטכניקה הנ ל, רנ א מ 1 העכבר נקבע אמפירי מספיק עבור ניתוח תעתיק (80 – 120 ng/μL).