Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

As defesas imunes inatas formam a primeira linha de defesa contra micróbios patogênicos. Estas respostas podem ser funcionalmente divididas em imunidade humoral e celular inata, ambos os quais são mediados por receptores de reconhecimento padrão germline codificado (PRRs) que detetam o patógeno associado padrões moleculares (PAMPs)¹. Muitas das vias de sinalização e mecanismos efetores da imunidade inata são conservados em mamíferos e invertebrados, como o nematódeo, Caenorhabditis elegans e a mosca da fruta, Drosophila melanogaster². A mosca de fruta tem emergido como um poderoso sistema para estudar a defesa do hospedeiro contra microorganismos infecciosos³. Drosófila é geneticamente tractable, fácil e barata, criados em laboratórios e tem um tempo de geração curto. Além disso, a mosca da fruta apresenta defesas altamente eficientes contra uma matriz de micróbios, permitindo que o exame da imunidade do hospedeiro contra patógenos virais, bacterianas, fúngicas ou parasitárias.

Drosófila imunologistas historicamente utilizaram telas genéticas para a frente, todo o genoma mediada por RNA interferência (RNAi seleção de linhas de células de inseto e pré-existentes cepas moscas mutantes para examinar a imunidade inata – levando à) identificação e caracterização de vários caminhos imune humoral evolutivamente conservada^4,5,6,7,8. A resposta imune inata humoral é, sem dúvida, o melhor caracterizada a defesa imunológica em moscas de fruta. Após a infecção, a resposta humoral leva para a produção e liberação sistêmica de peptídeo antimicrobiano moléculas (AMP) para a hemolinfa, o sangue equivalente em insetos. Amplificadores são produzidos pelo pedágio altamente conservado e Imd vias de sinalização. O pathway pedágio é homólogo de mamíferos receptor TLR/IL-1R sinalização e via Imd é homóloga à sinalização de mamíferos de fator de necrose tumoral-alfa. No pedágio da drosófila, sinalização é induzida por bactérias gram-positivas, fungos e Drosophila X virus^6,9,10 e Imd sinalização é induzida por bactérias Gram-negativas^{11 ,12}.

Imunidade celular, composta de encapsulamento, melanização e fagocitose de patógenos invasivos, realizada por células especializadas de sangue chamadas de hemócitos¹³. Existem três classes de hemócitos na mosca da fruta: cristal células, lamellocytes e plasmatocytes¹³. Pilhas de cristal, que compõem 5% dos hemócitos circulantes em larvas, liberam enzimas proPhenoloxidase (proPO) levando a melanização de agentes patogénicos e tecidos do hospedeiro em locais da ferida. Lamellocytes, que normalmente não são encontrados em embriões saudáveis ou larvas, são células aderentes que encapsulam objetos estranhos. Estas células são induzidas mediante pupariation ou quando parasitam ovos de Vespa são depositados em larvas. Plasmatocytes fagocíticas, que compõem 95% da circulação hemócitos em larvas e todos os restantes hemócitos em adultos, desempenhar um papel no tecido remodelação durante o desenvolvimento e, nomeadamente, servir como a célula principais efetoras da imunidade celular de Drosophila .

Fagocitose uma linha imediata e crucial de defesa imune inata; micróbios que quebrou a barreira epitelial do hospedeiro são rapidamente tragados e eliminados por células fagocíticas (para uma revisão abrangente da biologia das células de fagocitose consulte referência ¹⁴). Esse processo é iniciado quando o reconhecimento de padrões codificados germline receptores (PRRs) sobre hemócitos reconhecem patógenos associados a padrões moleculares (PAMPs) de micróbios. Uma vez acoplado para seus destinos, PRRs iniciem cascatas de sinalização que levam à formação de pseudopods através da remodelação de citoesqueleto de actina. Os pseudopods cercam o micróbio, que posteriormente é engolido e interiorizado em uma organela nascente, o fagossomo. Os micróbios são destruídos como o fagossoma sofre o processo de maturação do fagossoma quando o fagossoma é traficado para o interior do hematócito e acidifica através de uma série de interações com lisossomos. Em vitro e célula de estudos de biologia em células de mamíferos primária têm sido fundamentais para identificar e caracterizar os fatores que regulam a fagocitose, como os mamíferos do Fc-gama e C3b receptores^15,16. No entanto, a capacidade de executar telas em grande escala ou estudos in vivo são limitadas nos sistemas dos mamíferos.

Aqui nós apresentamos um ensaio in vivo para fagocitose em adultos de moscas de fruta, que é baseado em um procedimento introduzido pelo laboratório de David Schneider em 2000¹⁷. O laboratório de Schneider mostrou que sessile hemócitos agrupados ao longo do vaso dorsal abdominal prontamente fagocitam bactérias e esferas de poliestireno. Para visualizar a fagocitose, moscas são injetadas com partículas fluorescente etiquetadas (tais como Escherichia coli rotulado com isotiocianato de fluoresceína (e. coli –FITC)), incubadas durante 30 minutos para permitir que o tempo de hemócitos engolir as partículas e então injetado com trypan azul, que sacia a fluorescência de partículas não fagocitados durante o período de incubação. Voar vasos dorsais são então fotografados usando um microscópio fluorescente invertido. Este trabalho seminal, utilizar um experimento relativamente simples, demonstrado que hemócitos fagocitam bactérias e grânulos de látex, a fagocitose bacteriana podem ser inibidos pela pre-injeção de moscas com grânulos de látex, e que voa sem celular e humoral respostas imunes são suscetíveis nem de Escherichia coli. O ensaio apresentado neste relatório baseia-se o trabalho do laboratório Schneider para quantificar a fagocitose in vivo medindo a intensidade da fluorescência das partículas tragado por hemócitos vaso dorsal associado.

Semelhante à abordagem tomada nos sistemas dos mamíferos, Drosophila geneticistas inicialmente usado todo o genoma in vitro RNAi telas para identificar genes necessários para a resposta imune celular^{18,19,20 ,21,22,23}. No entanto, o desenvolvimento do ensaio fagocitose in vivo adulto habilitado experimentos de acompanhamento a efectuar facilmente em animais inteiros, permitindo assim que os investigadores para verificar o biológico o papel dos factores identificados em estudos in vitro. Tal foi o caso com o receptor do transmembrane comedor, que foi identificada pela primeira vez como um receptor bacteriano em uma tela de RNAi usando S2 células²⁴ e então mais tarde mostrada para mediar a Escherichia coli (e. coli),, Enterococcus faecalis, e fagocitose de Staphylococcus aureus (S. aureus) em adultos²⁵.

Nosso laboratório empregou o ensaio in vivo de fagocitose em telas de genéticas para a frente e estudos de associação de genoma-largo (usando o painel de referência genética drosófila (DGRP)) para identificar novos genes que regulam a fagocitose de hemócitos adultos. Estes estudos levaram à caracterização os receptores PGRP-SC1A e PGRP-SA²⁶, a vesícula intracelular tráfico de proteína Rab14²⁷, o glutamato transportador Polifemo²⁸e RNA-proteína obrigatória Fox-1²⁹.

Nós antecipamos que futuras telas incorporando a fagocitose in vivo podem levar à identificação de genes adicionais que são importantes para a resposta imune celular em Drosophila. Telas usando linhas puras totalmente sequenciado, tais como o DGRP ou a drosófila sintético população recurso (DSPR), podem identificar variantes naturais que afectam a fagocitose ou hematócito desenvolvimento. Além disso, a técnica poderia ser adotada em outras espécies de Drosophila ou usada para recursos da comunidade nova tela, como a coleção de 250 espécies de Drosophila , mantido pelo nacional drosófila espécie Stock Center (NDSSC ) em Cornell. Estas experiências podem ser realizadas usando fluorescente-etiquetadas bacteriana ou fúngica-parede bioparticles que estão disponíveis comercialmente, ou podem ser realizadas usando qualquer número de espécies bacterianas ou fúngicas – desde que o micróbio expressa marcadores fluorescentes .