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Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
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면역학 및 감염병학

Usando organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos para estudiar y modificar la protección de células epiteliales contra Salmonella y otros patógenos

Published: May 12, 2019
doi:
10.3791/59478
, , , , ,
1Wellcome Trust Sanger Institute, 2Department of Medicine,University of Cambridge, 3University of Cardiff

Summary

Los organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) ofrecen oportunidades emocionantes para modelar enfermedades entérica in vitro. Demostramos la diferenciación de los hiPSCs en los organoides intestinales (iHOs), la estimulación de estos iHOs con citoquinas, y la microinyección de Salmonella typhimurium en el lumen IHO, permitiendo el estudio de una invasión epitelial por este Patógeno.

Abstract

El sistema de ‘ organoides ‘ (iHO) intestinal, caracterizado porque las estructuras 3D representativas del revestimiento epitelial del intestino humano pueden ser producidas a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs) y mantenidas en la cultura, proporciona una oportunidad emocionante para facilitar el modelado de la respuesta epitelial a las infecciones entéricos. In vivo, las células epiteliales intestinales (IECs) desempeñan un papel clave en la regulación de la la homeostasis intestinal y pueden inhibir directamente los patógenos, aunque los mecanismos por los que esto ocurre no están completamente dilucidados. La citocina interleucina-22 (IL-22) ha demostrado desempeñar un papel en el mantenimiento y la defensa de la barrera epitelial intestinal, incluyendo la inducción de una liberación de péptidos antimicrobianos y quimioquinas en respuesta a la infección.

Describimos la diferenciación de los hiPSCs de control saludable en iHOs a través de la adición de combinaciones de citoquinas específicas a su medio de cultivo antes de incrustarlas en un sistema de cultivo prointestinal basado en matriz de membrana sótano. Una vez incrustados, los iHOs se cultivan en medios complementados con Noggin, R-spondin-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF), CHIR99021, prostaglandina E2, y diclorhidrato de Y-27632 monohidrato. Pasajes semanales por alteración manual de la ultrestructure iHO conducen a la formación de iHOs en Cierva, con algunos exhibiendo una estructura de cripta/vellosidades. Todos los iHOs demuestran un epitelio diferenciado compuesto por células de Copa, células enteroendocrinas, células de Paneth y enterocitos polarizados, que pueden confirmarse mediante inmunostenciamiento para marcadores específicos de cada subconjunto de células, microscopía electrónica de transmisión (TEM) y PCR cuantitativa (qPCR). Para modelar la infección, Salmonella enterica serovar typhimurium SL1344 se microinyecta en el lumen de los ihos e incubado por 90 min a 37 ° c, y se realiza un ensayo de protección de gentamicina modificada para identificar los niveles de invasión bacteriana. Algunos iHOs también son pretratados con IL-22 humano recombinante (rhIL-22) antes de la infección para determinar si esta citoquina es protectora contra la infección de Salmonella .

Introduction

En los últimos años, el estudio de las interacciones huésped-patógeno se ha mejorado con el desarrollo de modelos “organoides”, en los que las representaciones en 3D del epitelio intestinal se pueden producir a partir de varios progenitores. Los organoides ‘ primarios ‘ pueden generarse directamente a partir de células madre intestinales cosechadas a partir de biopsias intestinales. Además, los organoides intestinales se pueden generar a partir de los hiPSCs. Lo mismo se puede decir de numerosos tejidos, con1gástrico, hígado2, pancreático3,4, cerebro5,6, pulmón7, y la próstata8 organoides utilizados por muchos investigadores para modelar Enfermedad. Hay numerosas aplicaciones emocionantes del sistema organoide, incluyendo el modelado de cáncer9 y la detección de drogas10, pero aquí nos centramos en el uso de ihos como un modelo de infección, utilizando S. enterica serovar typhimurium (S. Typhimurium) como un patógeno ejemplar y pretratamiento con IL-22 como terapia.

En este estudio, los hiPSCs utilizados para generar iHO son IPSC ‘ Kolf2 ‘, generados a partir de un individuo sano y disponibles en el consorcio de la iniciativa de células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (HipSci; www.hipsci.org), un panel de referencia de acceso abierto de caracterizado líneas hiPSC11. Una ventaja de usar hiPSCs como progenitores para los organoides es que ahora hay extensos bancos de líneas iPSC de donantes sanos disponibles, lo que significa que los resultados pueden validarse en un número de líneas celulares con diferentes antecedentes genéticos. Además, si los investigadores desean ver los polimorfismos de nucleótidos únicos asociados a enfermedades específicas (SNPs), es posible utilizar CRISPR/Cas9 para diseñar mutaciones en una línea celular sana, produciendo así una línea mutante y conservando la isogénica línea de control para la comparación12. En nuestra experiencia, los organoides intestinales derivados de hiPSC son de mayor tamaño que sus homólogos primarios y más consistentes en la cultura, lo que hace que una microinyección menos complicada técnicamente y permita potencialmente una gama más diversa de patógenos para ser Estudiado. los iHOs pueden ser preservados criogénicamente, y hemos propagado cultivos iHO por hasta un año para producir material para la experimentación.

In vivo, los IECs desempeñan un papel clave en la regulación de la la homeostasis intestinal y pueden inhibir directamente los patógenos, aunque los mecanismos por los que esto ocurre no se entienden bien. La citoquina IL-22 es conocida por tener un papel en el mantenimiento de la barrera epitelial intestinal13 y está implicada en la inducción y secreción de péptidos antimicrobianos y quimioquinas en respuesta a la infección14. Se produce por las células T activadas (particularmente, Th17 células), así como por el asesino natural (NK) células y se une a un receptor heterodimérico compuesto de IL-22R1 y IL-10R2 subunidades15. El receptor de IL-22 se expresa basalmente en IECs, lo que significa que en el modelo iHO, es posible pretratar los organoides con rhIL-22 simplemente por su adición al medio de cultivo16. Una desventaja del sistema organoide es que carece de la respuesta inmune asociada normalmente entregada por otros tipos de células inmunitarias; sin embargo, surgen modelos que intentan coculture organoides con linfocitos intestinales para representar mejor este17,18.

El uso del sistema de microinyección es clave para simular infecciones en el modelo iHO, ya que esto permite la entrega directa de patógenos a la superficie apical del epitelio, como ocurriría en el caso de infección in vivo. La adición de fenol rojo a la solución bacteriana inyectada en la iHO marca los que han sido infectados, evitando así inyecciones repetidas de la misma iHO. Los organoides como recipientes para el modelado de infecciones están creciendo en uso, con patógenos como Helicobacter pylori,19 el norovirus,20 el rotavirus,21 Escherichia coliproductora de toxina Shiga22, Cryptosporidium23, y el virus del Zika24 habiendo demostrado sobrevivir y replicar dentro de estos sistemas. Esta tecnología podría aplicarse a una gama más amplia de patógenos, particularmente a los organismos que son difíciles de cultivo, como los protozoos, o patógenos humanos restringidos, con el fin de obtener información directa sobre la respuesta epitelial humana a la infección.

Protocol

1. culturación y Passaging de células madre pluripotentes inducidas Nota: Todos los métodos descritos aquí utilizan líneas celulares humanas disponibles comercialmente. Todo el trabajo de cultivo de tejidos detallado a continuación se debe hacer en una campana de flujo laminar de clase II. los IPSC se mantienen rutinariamente en el medio de cultivo de células madre (véase la tabla de materiales), según las instrucciones del fabricante, lo que permite una cultura de iPSCs sin fin de semana. los IPSC se pueden adaptar de otros sistemas de cultivo de la IPCS con relativa facilidad. Pasaje de las células una vez que las colonias cubren aproximadamente 80% – 90% de la superficie de la placa. Preparar las placas para el pasaje 1 h antes de su uso añadiendo vitronectina 10 μg/mL diluido en la solución salina de Dulbecco con tampón de fosfato (DPBS; sin calcio [ca] o magnesio [mg]) a placas tratadas con cultivo de tejido. Los volúmenes de recubrimiento dependen del tamaño de la placa y se pueden encontrar en las instrucciones del fabricante. Durante este tiempo, cultivo de células madre caliente medio a temperatura ambiente (RT). Retire los soportes de los iPSCs listos para el paso y lave las celdas 2x con DPBS (sin CA o mg). Agregue la solución EDTA (consulte la tabla de materiales) a las placas, asegurándose de que toda la superficie esté recubierta e incube en RT durante 5 – 8 min. Cuando los agujeros empiezan a aparecer en el centro de las colonias de iPSC, aspiran y desechan la solución EDTA. Añadir medio de cultivo de células madre a los pozos; desalojar los iPSCs lavando suavemente los medios sobre la superficie de la placa unas cuantas veces. Los IPSC están pasados como grumos y no como celdas individuales, así que asegúrese de que la solución EDTA no se deja encendida durante demasiado tiempo. Mueva cualquier iPSCs desalojado a un tubo cónico de 15 mL. Aspirar la vitronectina de las placas prerecubiertas y reemplazarla con medio de cultivo de células madre. Invierta la suspensión iPSC varias veces para asegurarse de que los iPSCs no se hayan asentado en la parte inferior del tubo cónico, y agregue el volumen adecuado de suspensión para dar una dilución 1:10 de las células en una placa nueva. Las proporciones divididas pueden ajustarse en función de la tasa de crecimiento de la iPSC, que puede variar entre líneas iPSC. Rocía el plato para dispersar los IPSC sobre la superficie y colócalo en una incubadora a 37 ° c/5% CO2. Alimentar el iPSCs el día después de la passaging. 2. diferenciación de los IPSC al hindgut En el día 0, divida el iPSCs en un plato tratado con cultivo de tejido de 10 cm, prerecubierto con vitronectina como se describe en el paso 1,2, en 10 ml de medio de cultivo de células madre complementado con Activin a (10 ng/ml) + factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF; 12 ng/ml). Añadir los factores de crecimiento a los medios directamente antes de su uso; hacerlo en todos los pasos subsiguientes. En el día 1, cambie el medio (10 ml de medio de cultivo de células madre con Activin A [10 ng/ml] + bFGF [12 ng/ml]). En el día 2, comience la diferenciación cambiando el medio a 10 ml de medio de cultivo de células madre complementado con los siguientes factores de crecimiento: Activin a (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), proteína morfolgenética ósea 4 (BMP-4; 10 ng/ml), Fosfoinositol 3- inhibidor de la quinasa LY294002 (10 μM) e inhibidor de GSK3 CHIR99021 (3 μM). En el día 3, cambie el medio a 10 ml de medio de cultivo de células madre complementado con Activin a (100 ng/ml), bfgf (100 ng/ml), BMP-4 (10 ng/ml) y LY294002 (10 μm). La especificación endoderm inducida por este medio debe dar lugar a cambios visibles en la morfología de la Colonia iPSC durante las próximas 24 h. En el día 4, cambie el medio a 10 ml de medios RPMI/B27 complementados con Activin a (100 ng/ml) y bfgf (100 ng/ml).Nota: Los medios RPMI/B27 contienen 500 mL de Medio RPMI con suplemento de L-glutamina (ver tabla 1), 10 ml de un suplemento B27 (50X, libre de suero) y 5 ml de aminoácidos no esenciales. Opcional: Añadir 5 mL de penicilina-streptomicina (10.000 U/mL). Esterilizar el filtro antes de su uso. En el día 5, cambie el medio a 10 ml de medios RPMI/B-27 complementados con Activin a (50 ng/ml). En el día 6, para comenzar a hacer un patrón del endodermo posterior al intestino trasero, cambie el medio a 10 ml de Medio RPMI/B27 COMPLEMENTADO con CHIR99021 (6 μm) + ácido retinoico (3 μm). En los días 7, 8y 9, repita el paso 2,7. Durante estos pasos, las estructuras 3-D visibles del intestino trasero deben ser evidentes, cubriendo la superficie de la placa. En el día 10, inserte el intestino trasero resultante en la matriz de membrana del sótano (consulte la tabla de materiales). 3. incrustación de la tripa trasera en matriz de membrana sótano Componen medios de crecimiento base iHO (500 mL de medio de águila modificada de Dulbecco avanzado [DMEM]/F12, 10 mL de suplemento B27 [50X, suero libre], 5 mL de suplemento N2 [100x, suero libre], 5 mL de 1 M 4-(2-hidroxietil) -1-ácido piperazineetanosulfónico (HEPES), y 5 mL de aminoácidos no esenciales [100x]. Opcional: Añadir 5 mL de penicilina-estreptomicina [10.000 U/mL]; esterilizar el filtro antes de su uso. Véase la tabla 1). Retire los medios de la placa posterior del intestino, y lave la placa 1X con DPBS (sin CA o mg). Añadir 5 mL de solución de colagenasa a la placa e incubar a 37 ° c durante 5 min. Producir solución de colagenasa añadiendo 500 mg de polvo de colagenasa IV a 400 mL de DMEM/F12 avanzada. A continuación, añadir 100 mL de recambio sérico (ver tabla de materiales), 5 ml de L-glutamina (200 mm), y 3,5 μl de 2-Mercaptoetanol, y remover la solución para mezclar. Esterilizar la solución una vez que el polvo de la colagenasa se disuelva completamente.Nota: Esto se puede almacenar a-20 ° c durante un máximo de 6 meses en alícullitas más pequeñas. Inactivar la colagenasa añadiendo 5 mL de medios de crecimiento base de iHO a la placa y raspar las células del intestino trasero utilizando un raspador celular, recogiendo la suspensión del intestino posterior en un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 240 x g durante 1 min y pipetear el sobrenadante. Añadir 10 mL de medio, romper el intestino trasero en trozos más pequeños por pipetear suavemente, y centrifugar de nuevo a 95 x g durante 1 min. Lave las celdas 2x en los medios de crecimiento base de iHO repitiendo el paso 3,5. Resuspenda las células en un pequeño volumen de medio de crecimiento base (~ 300 – 500 μL) y agregue alrededor de 100 μL de esta solución a 1,5 mL de matriz de membrana basal. La matriz debe permanecer en el hielo durante este tiempo, ya que comenzará a solidificar rápidamente en RT. Configurar una placa de 24-well en un calentador de placa a 37 ° c y detectar 60 μL en un pozo de la placa de 24-well. Permita que se ajuste brevemente y Compruebe la densidad bajo un microscopio. Si es necesario, agregue más solución intestinal posterior a la matriz de membrana del sótano en incrementos hasta que se logre la concentración deseada, y detectar la solución en los pozos restantes. Incubar a 37 ° c durante 10 min; a continuación, añadir 800 μL de medios de crecimiento base de iHO que contengan factores de crecimiento a cada pozo de la placa de 24-well en las siguientes concentraciones (ver tabla 1): 500 ng/ml R-spondin-1, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml factor de crecimiento epidérmico (EGF), 3 μm CHIR99021, 2,5 μm prostaglandina E2, y 10 μM Y-27632 diclorhidrato monohidrato (inhibidor de la roca). Cambie los medios de crecimiento base de la iHO cada 2 – 3 días, o inmediatamente si los medios empiezan a decolorarlos. Después de la siembra inicial en la matriz de membrana del sótano, permita que los iHOs se desarrollen durante 7 días antes de dividirlos. En el día 3 – 4, las esferas distintas deben ser visibles en la cultura. Para el cambio de medios por sí solo, omita Y-27632, ya que esto solo es necesario cuando se divide o se siembra. 4. mantenimiento y paso de iHOs Para permitir el descongelamiento gradual, coloque el volumen requerido de matriz de membrana del sótano en una cubeta de hielo cubierta a 4 ° c durante la noche, 24 h antes de la división. Retire los medios de los iHOs y reemplácelo con 500 μL de solución de elevación celular (consulte la tabla de materiales) por pozo. Incubar a 4 ° c durante 40 – 50 min, momento en el cual los iHOs deben estar flotando en la solución. Opcional: utilice un sistema de imágenes en el capó para seleccionar únicamente los iHOs con la morfología deseada (consulte la tabla de materiales). Pipetear suavemente la suspensión de la solución de elevación iHO/célula en tubos cónicos de 15 mL, tratando de no romper los iHOs. Permita que el IHOs se asiente durante 3 – 5 min y extraiga el sobrenadante y las células individuales. Resuspend el iHOs en 5 mL del medio de crecimiento base de iHO y pipetee suavemente para lavar. Centrifugar a 95 x g durante 2 min. Configure una placa de 24-well en un calentador de placas a 37 ° c dentro del capó. Extraer el sobrenadante y resuspensar los iHOs en ~ 300 – 500 μL de media de crecimiento base, utilizando una Piera P1000 para descomponer los iHOs en trozos más pequeños. Tenga en cuenta que la fuerza que debe aplicarse variará dependiendo de la línea de iHO y el estado de maduración, así que empiece suavemente, aumentando la fuerza si es necesario. Colocar ~ 100 μL de los iHOs (el volumen depende de la densidad de la solución) en 1,5 mL de la matriz de membrana del sótano y pipetear brevemente para mezclar. Detectar 1 x 60 μL de matriz de membrana del sótano en un pozo de la placa de 24-Well, dejarlo solidificar para ~ 30 s, y luego comprobar la densidad bajo el microscopio. Si la densidad es demasiado baja, agregue más iHOs a la matriz. Repita el paso 4,8 hasta que se adquiera la densidad correcta y, a continuación, descubra el resto de la matriz en una placa de 24-well. Colóquelo en una incubadora a 37 ° c durante 10 min y, a continuación, superponerlo con 800 μL de medio de crecimiento base con factores de crecimiento, como se describe en el paso 3,7. Para preparar los iHOs para un experimento de ensayo de invasión (descrito a continuación), pasar los iHOs 4 – 5 días antes del experimento como se describe en los pasos 4.1 – 4.10, pero colocar 120 μL de la solución de iHO de matriz generada en el paso 4,7 en platos de microinyección con fondo de vidrio de 5 mm. En lugar de dejar la suspensión de la iHO en una gota como con el paso de rutina, esparcir la gota sobre la parte inferior del plato para crear una capa delgada de matriz. Cubrir con 2,5 mL de medio de crecimiento base más factores de crecimiento.Nota: Si se han utilizado antibióticos en medio de cultivo, estos deben eliminarse y reemplazarse con medios no antibióticos suplementados para experimentos de microinyección. 5. prestimulación de iHOs con rhIL-22 Aspire los medios de comunicación de los iHOs y reemplácelo con medios de crecimiento de base frescos (que no deben contener antibióticos) 18 h antes del ensayo de invasión. Añadir rhIL-22 a los medios de cultivo a una concentración final de 100 ng/mL. 6. microinyección de los ensayos de iHOs y invasión intracelular El día anterior al experimento, configure S. Typhimurium SL1344 cultivo en 10 mL de caldo Luria-Bertani e incubar a 37 ° c durante la noche con agitación. El día del experimento, si hay disponible un microscopio con una cámara de calor cerrada, enciente y permita que la temperatura llegue a 37 ° c antes de iniciar el ensayo. Diluir cultivos bacterianos durante la noche en DPBS (conteniendo CA y mg) a una densidad óptica de 2 a 600 nm (OD600) y, a continuación, mezclar 1:1 con fenol rojo. Cargue el plato de microinyección que contiene iHOs en la etapa del microscopio, quite la tapa y coloque los iHOs en foco, listos para que comience la inyección. Encienda el inyector y las estaciones de control del brazo. Asegúrese de que el inyector esté ajustado a una presión de 600 kPa y un tiempo de inyección de 0,5 s. Si aún no está retrocedido en la etapa del microscopio, gire el brazo de inyección para asegurarse de que esté. Configure una punta de perforación de microinyección de 6 μm quitando el envoltorio y el cilindro de plástico de la aguja. Retire el cabezal de agarre del brazo de inyección. Cargue la punta del taladro con 10 μL del inóbulo, agarrando la punta del taladro suavemente en su extremo romo. Coloque la punta de perforación en el cabezal de agarre y vuelva a conectarlo al brazo de microinyección. Mueva suavemente el brazo a su posición para que la aguja esté situada a 1 – 2 cm por encima de la placa de microinyección. Utilice el control de brazo para colocar la punta de la aguja en el centro de la antena y bajarla hasta que esté justo sobre la superficie de los medios. Programar la estación de control de brazo para devolver la aguja a este punto después de todas las inyecciones. Enfoca el microscopio en los iHOs y selecciona el objetivo a inyectar. Coloque la aguja justo arriba y a la derecha de la iHO para inyectarse y mover la aguja hacia abajo y lateralmente en el lumen del iHO. Presione el botón inyectar en el microinyector; la mezcla bacteriana manchada de fenol emergerá de la aguja. Inyecte cada iHO 3x. Inyecte al menos 30 iHOs por condición.Nota: Debido a la heterogeneidad en el tamaño y la estructura de la iHO dentro de una cultura, es necesario inyectar un gran número de iHOs para controlar la variación. Cuando se inyecten todos los iHOs requeridos, extraiga la placa de microinyección del escenario, sustituya la tapa e incube la placa a 37 ° c durante 90 min. Después de 90 min, aspirar el medio de crecimiento y reemplazarlo con 3 mL de solución de elevación celular; incubar a 4 ° c durante 45 min. Mueva suavemente la solución de levantamiento de iHOs/célula a un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de DPBS. Asegúrese de que todos los iHOs inyectados se hayan retirado de la placa (enjuague la placa con 1 mL del DPBS si es necesario). Centrifugar a 370 x g durante 3 min. Extraer el sobrenadante y resuspensar los iHOs en medios de crecimiento base que contengan gentamicina a 0,1 mg/mL (Añadir 1 mL de media; a continuación, utilice una picada P1000 ~ 50X para romper los iHOs, y añada 4 mL de otros medios). Incubar a 37 ° c durante 1 h para matar las bacterias extracelulares. Centrifugar los iHOs a 370 x g durante 3 min y aspirar el sobrenadante, dejando lo menos posible. Lavar el iHOs 1X con DPBS y centrifugar de nuevo.Nota: Este paso elimina la gentamicina, que es importante ya que cualquier gentamicina restante puede matar las bacterias intracelulares una vez que las células son lisadas. Resuspend el iHOs en 500 μL de tampón de lisis (ver tabla de materiales) y disocie manualmente los organoides pipeteando ~ 50X. Deje esta mezcla durante 5 min en RT. Diluir en serie la solución resultante 10 veces en DPBS para generar concentracionesde 10-1, 10-2y 10-3 . Pipetear 3 x 20 μL de gotas de las soluciones ordenadas y diluidas en placas de agar LB precalentadas. Incubar durante la noche a 37 ° c y realizar el conteo de colonias y el cálculo de las unidades formadoras de colonias (CFU). Los recuentos de colonias reflejarán el número de bacterias intracelulares que se liberaron durante el proceso de alisado celular. 7. congelación y recuperación de la célula Nota: Como se indicó anteriormente, es posible preservar criogénicamente los iHOs y reconstituirlos cuando se desee. A continuación se detallan los procesos de congelación y descongelamiento. Seleccione los pozos de iHOs que desea congelar. Añadir la solución de elevación celular a los pozos e incubar durante 40 – 50 min a 4 ° c. Los iHOs deben estar flotando en la solución. Pipetear suavemente los iHOs en un tubo cónico de 15 mL y dejar que se asientan. Retire los medios y lave el iHOs 1X con medios de crecimiento base (sin factores de crecimiento). Centrifugar a 95 x g durante 2 min, retirar el sobrenadante, y reemplazarlo con un volumen adecuado de medio de congelación celular (ver la tabla de materiales; utilice el medio según las instrucciones del fabricante), decantando los ihos en viales criogénicos. Almacene los viales en un congelador de-80 ° c durante la noche para permitir una congelación más gradual; Luego, transfiéralos al almacenamiento de nitrógeno líquido. Para reconstituir los iHOs, descongele rápidamente un vial criogénico a 37 ° c utilizando un baño de agua/talón; a continuación, pipetear suavemente su contenido en 10 mL de medio de crecimiento base (sin factores de crecimiento). Permita que los iHOs se asientan y reemplacen los medios con ~ 300 μL de media de crecimiento de base fresca. NO disocie manualmente los iHOs. Añadir iHOs a la matriz de membrana del sótano y la placa de salida como se describe en la sección 3.

Representative Results

Después del comienzo del proceso de diferenciación, las células deben pasar a través de la etapa de la formación del endodermo definitivo seguida por el patrón posterior del intestino antes de la incrustación en la matriz de membrana del sótano. Se formarán esferoides y las culturas con grandes cantidades de material contaminante se aclararán durante un período de varias semanas a medida que los iHOs maduran. Las imágenes ejemplares de la diferenciación, incrustación y proceso de paso se muestran en la figura 1. La configuración del sistema de microinyección es como se muestra en la figura 2. Los iHOs son microinyectados con la solución de rojo/bacteriano de fenol y conservan su color rojo, permitiendo la identificación de iHOs infectados para prevenir inyecciones duplicadas. Los recuentos de bacterias intracelulares chapadas se realizan siguiendo el ensayo de protección de gentamicina modificado; prestimulación con rhIL-22 restringe el S. Infección por typhimurium, con menos bacterias intracelulares observadas después del tratamiento con rhIL-22 (figura 3). También procesamos rutinariamente los iHOs infectados para inmunostaining, o TEM, con el fin de facilitar la visualización de las interacciones IEC-bacterianas hospedador (figura 4). Figura 1: diferenciación dirigida de los IPSC a los iHOs. Secuencia representativa de diferenciación de IPSC a iHOs, demostrando los cambios morfológicos observados y los factores de crecimiento requeridos para impulsar estos cambios. El endodermo definitivo se forma en el día 4 de la diferenciación, tras la exposición a concentraciones específicas de combinaciones de Activin A, FGF, BMP-4, LY294002 y CHIR99021. Después de 8 días, el patrón de este endodermo definitivo con concentraciones específicas de CHIR99021 y ácido retinoico resulta en la formación del intestino. Se observa la formación de postincrustación y esferoide. Después de un paso prolongado usando una matriz de membrana basal de apoyo superpuesta con medio complementado con factores de proliferación prointestinal R-spondin 1, Noggin, EGF, CHIR99021, y prostaglandina E2, los esferoides progresan en el iHOs en Cierva. (Se tomaron imágenes a una magnificación de 4x – 10x). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: microinyección de una iHO con S. Typhimurium. (A) el sistema de microinyección (ver la tabla de materiales) encerrado en la cámara ambiental; Esto permite la inyección de los iHOs en un ambiente controlado (37 ° c/5% CO2). (B) el inóbulo bacteriano se entrega directamente en el lumen IHO utilizando un microcapilar unido al sistema de microinyección. (C) mezclando inódulos bacterianos con fenol rojo, está claro qué ihos han sido infectados, evitando así inyecciones duplicadas de la misma IHO. Las imágenes fueron tomadas con un aumento de 10X. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: El pretratamiento de iHOs derivado de la línea celular Kolf2 con rhIL-22 restringe la S. Typhimurium SL1344 invasión en células epiteliales intestinales. Para los ensayos de protección de gentamicina, los iHOs fueron tratados con 100 ng/mL de rhIL-22 18 h antes de la infección, o no se trataron, y se incuvaron durante 90 minutos después de la infección. Los datos son medios de tres réplicas técnicas para tres réplicas biológicas ± SEM. Para pruebas de significancia, se utilizaron pruebas U de Mann-Whitney; p < 0,0001. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: interacción de las IECs con S. typhimurium SL1344. Estos paneles demuestran iHOs inyectados con S. Typhimurium SL1344 e incubado durante 3 h, antes de la fijación y procesamiento para (A) inmunofluorescencia o (B) microscopía electrónica de transmisión. En el panel A, las bacterias se ven dentro de la IHO lumen e interactúan con el epitelio. Los núcleos están manchados con 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) dilactato (azul), las membranas celulares con Phalloidin (rojo), y las bacterias con CSA-1 (verde). Las imágenes se toman con un aumento de 20x. El panel B muestra tres vías de procesamiento intracelular diferentes de Salmonella tras la invasión; bacterias se observan (a) dentro de una vacuola que contiene Salmonella, (b) libre dentro del citoplasma, y (c) sometidos a autofagia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Medio RPMI/B27 Componente: Cantidad: RPMI 1640 medios con suplemento de glutamina 500 mL B27 sin suero suplemento 50X 10 mL medio de crecimiento base iHO Componente: Cantidad: Advanced DMEM/F12 500 mL B27 sin suero suplemento 50X 10 mL Suplemento libre de suero N2 100x 5 mL HEPES 1 M 5 mL L-glutamina 200 mM 5 mL Factores de crecimiento para el medio de crecimiento base iHO Componente: Cantidad: R-spondin1 humano recombinante 500 ng/mL Noggin humano recombinante 100 ng/mL Factor de crecimiento epidérmico (EGF) 100 ng/mL Prostaglandina E2 2,5 μM CHIR99021 3 μM Y-27632 dihidrocloruro monohidrato 10 μM Tabla 1: recetas de medios.

Discussion

Este protocolo describe la diferenciación de los hiPSCs en los iHOs y su utilidad como modelo para simular infecciones entéricos. A continuación, describimos los pasos críticos en el protocolo y las modificaciones o mejoras que hemos realizado.

Este protocolo agiliza el proceso de diferenciación de los hiPSCs en comparación con el trabajo publicado anteriormente25. Los métodos utilizados anteriormente requerían la transferencia de los hiPSCs de otros sistemas de cultivo de hiPSC (por ejemplo, la cultura hiPSC dependiente del alimentador) al medio químicamente definido – alcohol polivinílico (CDM-PVA). Esta transferencia a CDM-PVA suele tardar de 2 a 3 semanas y requiere la alimentación diaria de los hiPSCs. Este protocolo tampoco fue consistentemente eficaz, con algunas diferenciaciones fallando; por lo tanto, se triplicó la diferenciación utilizando los mismos factores de crecimiento, pero comenzando con los hiPSCs cultivados en medio de cultivo de células madre (en lugar de CDM-PVA) y el reemplazo de CDM-PVA con medio de cultivo de células madre durante los días de diferenciación 0 – 3. Esto ha sido exitoso para las cinco líneas independientes de hiPSC, que hasta ahora se han triplicado, lo que hace que el proceso de diferenciación sea mucho más rápido y eficiente. Esto también permite el cultivo libre de fines de semana de los hiPSCs antes de la diferenciación, lo que permite una mayor flexibilidad en la cultura hiPSC. las líneas iHO producidas por este método han sido fenotipadas para los marcadores del epitelio intestinal como hemos descrito anteriormente para las líneas hiPSC Kolf2, Yemz1 y Lise116 y aparecen fenotípicamente indistinguibles de los ihos producidos usando el anterior Protocolo.

Después de la siembra, los iHOs requieren al menos 1 mes de paso de rutina, con la división cada 4 – 7 días para facilitar la maduración. Tenga en cuenta que habrá alguna variación en el desarrollo de la iHO dependiendo de la línea iPSC utilizada y la densidad de la cultura inicial. Durante los primeros pasajes, habrá células visiblemente contaminantes que no son iHOs. Estos eventualmente morirán, dejando una cultura limpia de esférica y, después de aproximadamente 4 semanas, iHOs en Cierva. Además, se puede utilizar un sistema de imagen en el capó para seleccionar y pasar únicamente los iHOs con la morfología deseada. A medida que los iHOs maduran, requerirán la división cada 6 – 7 días, dependiendo de la tasa de crecimiento y la densidad. Si ocurre cualquiera de los siguientes, los iHOs deben dividirse antes de este punto: las cavidades luminales de los iHOs empiezan a llenarse con células muertas, la matriz de membrana basal comienza a desintegrarse, los iHOs empiezan a crecer fuera de la matriz de membrana del sótano, o la cultura es demasiado denso y los medios empiezan a ir de amarillo muy rápidamente.

Una vez que se establece la cultura de la iHO, si en algún momento la aparición de los iHOs cambia o es diferente de lo esperado (por ejemplo, los cultivos permanecen esféricos, en lugar de en ciernes), fenotipado a través de inmunohistoquímica y qPCR para marcadores celulares deben ser repite para asegurar que la diferenciación de los tipos celulares dentro de los iHOs (p. ej., células de Copa, células de Paneth) permanezca intacta. Si los iHOs ya no son diferenciadores, entonces deben desecharse y reconstituirse o un pasaje anterior de los iHOs debe ser descongelado y reconstituido. Si los iHOs dejan de diferenciarse, las causas potenciales son la edad de la cultura (si tiene más de 6 meses de antigüedad), la actividad de los factores de crecimiento (Asegúrese de que se reconstituyen según las instrucciones del fabricante y se mantienen congeladas en pequeñas alícullitas para evitar múltiples ciclos de congelamiento-descongelación), pasajes demasiado frecuentes o violentos (en general, el passaging sólo debe ocurrir una vez a la semana, y si los iHOs se disocian manualmente con demasiada fuerza sobre una base regular, dejarán de diferenciarse por completo).

Establecimos a través de la secuenciación de ARN que la estimulación Il-22 18 h antes de la infección estimula genes antimicrobianos y los involucrados en el fenotipo de defensa de barrera. Antes del uso de nuevo ihso para ensayos que implican prestimulación con rhil-22 (o una citoquina alternativa si el sistema se está utilizando para esto), es aconsejable comprobar la actividad de los genes que se sabe que son alza por la citoquina (en el caso de Il-22 , usamos DUOX2 y LCN2) a través de qPCR después de la estimulación de los ihos, para asegurar la expresión del receptor y la señalización intacta. Antes del primer uso de IL-22, también llevamos a cabo la inmunohistoquímica para ubicar el receptor IL-22 en iHOs para establecer que la expresión del receptor IL-22 era basal, lo que significa que la prestimulación podría lograrse simplemente agregando rhIL-22 a la cultura iHO Medio. Sin embargo, si se expresa un receptor apicamente, este protocolo puede tener que ser adaptado para entregar los ligandos apicamente.

Las trampas relacionadas con el sistema de microinyección generalmente se relacionan con la delicadeza de las agujas requeridas para la inyección. Aquí, utilizamos puntas de taladro disponibles comercialmente con un lumen de 6 μm. Es posible tirar las agujas de inyección de los capilares de vidrio26 aunque esto puede ser menos uniforme, lo que conduce a fugas de la punta de la aguja o volúmenes inconsistentes que se inyectan en los ihos. Es importante asegurarse de que la inyección ha tenido lugar en el lumen del iHO, que es una razón para el uso de rojo fenol como un tinte; los iHOs se expandirán y sostenán visiblemente el inóbulo rojo, permitiendo la certeza sobre qué iHOs han sido inyectados. Ocasionalmente las agujas se obstruyen con escombros de la pared de la iHO; Si este es el caso, quite la punta de la aguja del interior de la iHO y presione el botón Clean en el sistema de microinyección. Esto producirá un breve período de mayor presión de aire que debe despejar el bloqueo. También inducirá alguna fuga del inóbulo bacteriano en la placa; por lo tanto, si esto ocurre, la acción limpia debe repetirse en todas las placas para asegurar la igualdad de inóbulo bacteriano por placa. Una gran ventaja de los iHOs derivados de hiPSC es su tamaño. Los organoides intestinales de los ratones y los organoides humanos primarios son mucho más pequeños (miden hasta ~ 100 μm y 100 – 300 μm, respectivamente27, versus 250 – 1500 μm para los ihos derivados de hipsc), lo que significa que las inyecciones de grandes cantidades de organoides serán más lentas. Esto permite que los experimentos de inyección a mayor escala sean trialed en los iHOs derivados de hiPSC. También es posible estudiar el contenido luminal de los iHOs cosechándolos después de la infección y disociando manualmente los iHOs en DPBS, liberando su contenido luminal. Para la microinyección, recomendamos el uso de una alta concentración de bacterias. Descubrimos que las concentraciones más bajas no eran suficientes para generar una respuesta de los IECs que comprendían los iHOs. Adicionalmente, fue difícil ubicar posteriormente bacterias internalizadas usando microscopía. Los ininlums pueden tener que optimizarse para diferentes cepas bacterianas.

En Resumen, los iHOs derivados de hiPSC proporcionan un modelo prometedor para diseccionar directamente la respuesta epitelial a las infecciones entínicas, ya sea mediante el estudio de recuentos de invasiones intracelulares, imágenes, medición de los niveles de citocinas en los sobrenadantes de la iHO o ARN de recolección para estudiar los cambios transcripcionales después de la exposición a patógenos. Su utilidad será aún más evidente en el futuro para el establecimiento de modelos de infección para patógenos de restricción humana y en la explotación de las posibilidades de utilizar esta tecnología para personalizar la investigación mediante el estudio de mutaciones genéticas relacionadas con enfermedades específicas y las respuestas de medicamentos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue respaldado por la financiación de Wellcome Trust, la Fundación Gates y el centro de investigación biomédica de Cambridge. E.A.L. es un estudiante de doctorado clínico con el apoyo de Wellcome Trust.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
5 mm glass bottom injection dishes MatTek corporation P50G-0-14-F
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010
Alexa fluor 647 phalloidin Life Technologies A22287 Use at 1:1000 concentration
B27 serum-free supplement Life Technologies 17504044 Stock concentration 50x, final concentration 1x
BMP-4 recombinant human protein R&D PHC9534 Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL
Cell recovery solution (cell lifting solution) BD 354253
CHIR99021 Abcam  ab120890-5mg Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM
Collagenase, type IV powder Life Technologies 17104019 Reconstitute at 0.1%
Corning cryogenic vials Corning 430487
Costar TC treated 24 well culture plates Corning CLS3527
DAPI dilactate Sigma-Aldrich D9564-10MG Use at 10 nM concentration
Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) Life Technologies 14190-144
Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662-100ML
Epidermal growth factor R&D 236-EG-200 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) Eppendorf 920000011
Eppendorf Femtojet express  (microinjection system) Eppendorf 5248 000.017
Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) Life Technologies A2858501
EVOS XL imaging system (in-hood imaging system)
Gentamicin Sigma-Aldrich G1272-10ML Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL
Goat anti-Salmonella, CSA-1 Insight Biotechnology 02-91-99 Use at 1:20 concentration
HEPES 1 M Life Technologies 15630056
KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) Gibco 10828010
GlutaMAX supplement (glutamine supplement ThermoFisher
L-glutamine Life Technologies A2916801 Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM
LY294002 Promega UK V1201 Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM
Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) Corning 356231
MEM non-essential amino acids  solution (100x) Gibco 11140035
N2 serum-free supplement Life Technologies 17502048 Stock concentration 100x, final concentration 1x
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15140163 Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL
Phenol red Sigma-Aldrich P0290-100ML
Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter Eppendorf 5195000087
Prostaglandin E2 Sigma P0409-1MG Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM
Recombinant human FGF basic R&D 233-FB-025 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recombinant human IL-22 R&D 6057-NG-100 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recombinant human Noggin R&D 6057-NG-100 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL 
Recombinant human R-spondin1 R&D 4645-RS-025 Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL
Recombinant human/mouse/rat Activin A R&D 338-AC-050 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) Gibco 12648010
Retinoic acid Sigma-Aldrich  R2625-50MG Stock concentration 3μM, final concentration 3mM
RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) Life Technologies 61870010
Triton X-100 (cell lysis buffer) Sigma-Aldrich RES9690T-A101X Use at 1% concentration
Versene (EDTA solution) Life Technologies 15040066
Vitronectin XF Stemcell Technologies  7180
Y-27632 dihydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich Y0503-1MG Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM
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References

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Lees, E. A., Forbester, J. L., Forrest, S., Kane, L., Goulding, D., Dougan, G. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens. J. Vis. Exp. (147), e59478, doi:10.3791/59478 (2019).
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