Bewertung einer universellen, veralteten Transcription Polymerase Chain Reaction zur Erkennung von Lyssaviren
Summary
Ein Pan-Lysavirus verschachtete Umkehr-Transkription Polymerase-Kettenreaktion wurde entwickelt, um speziell alle bekannten Lyssaviren zu erkennen. Die Validierung mit Tollwut-Hörnproben verschiedener Tierarten ergab, dass diese Methode eine Empfindlichkeit und Spezifität hat, die dem Gold-Standard-Fluoreszenz-Antikörper-Test entspricht und für die routinemäßige Tollwutdiagnostik verwendet werden könnte.
Abstract
Um Tollwut-Virus und andere Mitgliedsarten der Gattung Lyssavirus in der Familie Rhabdoviridaezu erkennen, wurde das Pan-Lysavirus verschachtelte Umkehr-Transkription Polymerase-Kettenreaktion (verschachteltes RT-PCR) entwickelt, um die konservierte Region zu erkennen Das Nucleoprotein (N) Gen der Lyssaviren. Die Methode wendet die umgekehrte Transkription (RT) an, wobei virale RNAals Schablone und Oligo (dT) 15 und zufällige Hexamer als Primer verwendet werden, um die virale Komplementär-DNA (cDNA) zu synthetisieren. Dann wird die virale cDNA als Vorlage verwendet, um ein 845 bp N-Gen-Fragment in der ersten Runde PCR mit äußeren Primern zu verstärken, gefolgt von Zweitrunden-verschachteltem PCR, um das endgültige 371 bp-Fragment mit inneren Primern zu verstärken. Diese Methode kann verschiedene genetische Ketten von Tollwut-Viren (RABV) erkennen. Die Validierung, mit 9.624 Hirnproben von acht heimischen Tierarten in 10 Jahren klinischer Tollwut-Diagnosen und Überwachung in China, zeigte, dass die Methode 100% Empfindlichkeit und 99,97% Spezifität im Vergleich zu den direkten Fluoreszenzerkrankungen hat Antikörpertest (FAT), die von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) und der Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE) empfohlene Goldstandard-Methode. Darüber hinaus könnte die Methode auch das gezielte N-Gen-Fragment von 15 anderen zugelassenen und zwei neuartigen Lyssavirus-Arten im 10. Bericht des Internationalen Komitees für die Besteuerung von Viren (ICTV), wie durch eine mimische Erkennung von synthetisierten N Gen-Plasmide aller Lyssaviren. Das Verfahren bietet eine bequeme Alternative zu FAT für die Tollwutdiagnose und ist als National Standard (GB/T36789-2018) von China zugelassen.
Introduction
Tollwut ist eine weltweite Zoonos-Krankheit, die durch Viren innerhalb der Gattung Lyssavirus 1 verursachtwird. Lyssaviren (Familie Rhabdoviridae) sind einfallslose RNA-Viren mit einem etwa 12 kb-Genom, das fünf Proteine kodiert: N, Phosphoprotein (P), Matrix-Protein (M), Glykoprotein (G) und das große Protein oder Polymerase (L). Basierend auf Nukleotidsequenzen des N-Gens, der genetischen Distanz und der antigenen Muster wurden die Lyssaviren in 16 Arten unterteilt, die das klassische Tollwut-Virus (RABV) und die Tollwutviren (RRV) umfassen: Lagos-Batt-Virus (LBV), Duvenhage-Virus (DUVV) ), Mokola-Virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), Australische Fledermaus lyssavirus (ABLV), Aravan Virus (ARAV), Ikoma Virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV), Irkut Virus (IRKV), Khujand-Virus (KHUV), Westkaukasischer Fledermau-Virus (WCBV), Shimoni-Bmeldchen-Virus (SHIBV), und Lleida Fledermaus Lyssavirus (LLEBV)2. In jüngster Zeit wurden zwei zusätzliche Lyssaviren identifiziert: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) von einer Brandt-Fledermaus (Myotis brandtii)in Finnland im Jahr 2017 3 und Taiwan bat lyssavirus (TWBLV) von einer japanischen Pipistrelle isoliert ( Pipistrellus abramus) in Taiwan, China 2016– 2017 4.
Alle Säugetiere sind anfällig für Tollwut; Allerdings erlauben keine groben pathognomonischen Läsionen oder spezifische klinische Anzeichen ihre Identifizierung, und die Diagnose kann nur im Labor5erfolgen. Die am weitesten verbreitete Methode zur Tollwutdiagnose ist die FAT, die sowohl von der WHO als auch von der OIE5,6 alsGoldstandardangesehenwird. Dennoch kann der FAT unzuverlässige Ergebnisse bei degradided/autolysierten Hirngewebsproben liefern. Darüber hinaus kann es nicht verwendet werden, um biologische Flüssigkeitsprobe wie Hirnspinalflüssigkeit (CSF), Speichel und Urin zu unterlassen, wodurch die Verwendung in der antemortem-Diagnose 7 weitgehendausgeschlossen wird. Alternative konventionelle diagnostische Tests, wie der Tollwut-Gewebekultur-Infektionstest (RTCIT) und der Maus-Impfung (MIT), erfordern mehrere Tage6, ein großer Nachteil, wenn eine schnelle Diagnose unerlässlich ist.
Verschiedene molekulare Diagnosetests (z.B. der Nachweis der viralen RNA durch RT-PCR, der PCR – Enzym-verknüpfte immunsorsorbierte Assay [PCR-ELISA], In-situ-Hybridisierung und Echtzeit-PCR) werden alsschnelle und sensible Techniken für die Tollwettung eingesetzt 8. RT-PCR wird jetzt von OIE für die routinemäßige Tollwutdiagnose empfohlen, und eine heminachente (hn) PCR wird im OIE-Handbuch für Diagnostiktests und Impfstoffe für terrestrische Tierebeschrieben, um alle Lyssaviren 5 zu erkennen. Hier beschreiben wir ein pan-Lyssavirus verschachtelten RT-PCR, das die spezifische und sensible Erkennung aller 18 Lyssavirus-Arten ermöglicht, die mit der FAT vergleichbar sind oder sie übertreffen. Das Prinzip der Methode ist ein RT der Ziel-RNA (konservierte Region des Lyssavirus N-Gens) in cDNA, gefolgt von der Verstärkung der cDNA um zwei Runden PCR. Die cDNA unterzieht sich der ersten Runde PCR mit äußeren Primern, um ein 845 bp-Fragment zu verstärken; Die Second-round-PRR verwendet dann das PCR-Produkt der ersten Runde als Vorlage, um ein 371 bp-Fragment mit inneren Primern zu verstärken. Die beiden PCR-Runden erhöhen die Empfindlichkeit des Tests deutlich.
Protocol
Representative Results
Discussion
Derzeit ist RABV ein großes Lyssavirus, das für fast alle Menschen-und TiertRAB-Tollwut in China sowie in anderen Ländern verantwortlich ist. Zudem wurde erstmals eine IRKV-Variante von einem Murina leucogaster Fledermaus in der Provinz Jilin im Nordosten Chinas im Jahr 201210identifiziert, und es wurde berichtet, dass es in der Provinz Liaoning 2017 11Uhrden Tod eines Hundes verursacht. Zuletzt war auch ein neuartiges Lyssavirus, TWBLV, von einer japan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde durch den National Key Research and Development Plan (Grant Nr. 2016YFD0500401) und die National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 31302043) unterstützt.
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
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