Evaluatie van een universele geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie voor de opsporing van Lyssaviruses
Summary
Een pan-Lyssavirus geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie is ontwikkeld om specifiek te detecteren alle bekende lyssaviruses. Validatie met behulp van rabiës hersenen monsters van verschillende diersoorten bleek dat deze methode een gevoeligheid en specificiteit gelijkwaardig is aan de gouden standaard fluorescerende antilichaam test en kan worden gebruikt voor routine hondsdolheid diagnose heeft.
Abstract
Voor het opsporen van rabiësvirus en andere lid soorten van het geslacht Lyssavirus binnen de familie Rhabdoviridae, de pan-Lyssavirus geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reaction (geneste RT-PCR) werd ontwikkeld om de geconserveerde regio te detecteren van het nucleoproteïne (N) gen van lyssaviruses. De methode past omgekeerde transcriptie (RT) toe gebruikend Viral RNA als malplaatje en oligo (dT)15 en willekeurige hexamers als inleidingen om het virale bijkomende DNA (cDNA) te synthetiseren. Dan, wordt virale cDNA gebruikt als malplaatje om een fragment van het gen van 845 BP N in eerste ronde PCR te versterken gebruikend buiten inleidingen, die door tweede-ronde geneste PCR worden gevolgd om def. 371 te versterken BP fragment gebruikend binnenprimers. Deze methode kan detecteren verschillende genetische bekleed van rabiës virussen (RABV). De validatie, met behulp van 9.624 hersen specimens uit acht huisdier soorten in 10 jaar van klinische rabiës diagnoses en surveillance in China, bleek dat de methode 100% gevoeligheid en 99,97% specificiteit in vergelijking met de directe fluorescerende de test van het antilichaam (vet), de gouden standaardmethode die door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) en de Wereldorganisatie voor dierlijke gezondheid (OIE) wordt geadviseerd. Bovendien kan de methode ook specifiek versterken de beoogde N-gen fragment van 15 andere goedgekeurde en twee nieuwe Lyssavirus soorten in het 10e verslag van het Internationaal Comite voor de taxonomie van virussen (ICTV), zoals geëvalueerd door een na te bootsen detectie van gesynthetiseerde N de plasmiden van het gen van al lyssaviruses. De methode biedt een handig alternatief voor vet voor rabiës diagnose en is goedgekeurd als een nationale norm (GB/T36789-2018) van China.
Introduction
Rabiës is een wereldwijde zoönose die wordt veroorzaakt door virussen binnen het geslacht Lyssavirus1. Lyssaviruses (familie Rhabdoviridae) zijn enig-negatief-gestrande virussen van RNA met een ongeveer 12 KB genoom dat vijf proteïnen codeert: N, Phosphoprotein (P), matrijsproteïne (M), glycoproteïne (G), en het grote proteïne of de polymerase (L). Op basis van nucleotide sequenties van het N gen, genetische afstand, en antigene patronen, de lyssaviruses zijn onderverdeeld in 16 soorten, bestaande uit klassieke rabiësvirus (RABV) en de rabiës-gerelateerde virussen (RRV): Lagos bat virus (LBV), Duvenhage virus (DUVV ), Mokola virus (MOKV), Europese knuppel Lyssavirus 1 (EBLV-1), Europese knuppel Lyssavirus 2 (EBLV-2), Australische knuppel Lyssavirus (ABLV), Aravan virus (Frédéric), Ikoma virus (IKOV), Bokeloh knuppel Lyssavirus (BBLV), Gannoruwa knuppel Lyssavirus (GBLV), Irkoet virus (IRKV), Khujand virus (KHUV), het westen Kaukasische knuppel virus (WCBV), Shimoni het virus van de knuppel (SHIBV), en de knuppel Lyssavirus van Lleida (LLEBV)2. Onlangs zijn twee extra lyssaviruses geïdentificeerd: Kotalahti bat Lyssavirus (KBLV) geïsoleerd van een brandt ‘ bat (Myotis brandtii) in Finland in 20173 en Taiwan bat Lyssavirus (TWBLV) geïsoleerd van een Japanse vleermuis ( Pipistrellus abramus) in Taiwan, China in 2016 – 20174.
Alle zoogdieren zijn vatbaar voor rabiës; echter, geen grove Pathognomonisch laesies of specifieke klinische symptomen mogelijk zijn identificatie, en de diagnose kan alleen worden gemaakt in het laboratorium5. De meest gebruikte methode voor hondsdolheid diagnose is het vet, dat wordt beschouwd als de gouden standaard door zowel de WHO en de OIE5,6. Niettemin, het vet kan produceren onbetrouwbare resultaten op gedegradeerde/autolyzed hersenweefsel monsters. Bovendien, het kan niet worden gebruikt om biologische vloeistoffen monsters zoals hersenvocht (CB), speeksel, en urine Assay, waardoor grotendeels uitschakeling zijn werkgelegenheid in antemortem diagnose7. Alternatieve conventionele diagnostische tests, zoals de hondsdolheid weefselkweek infectie test (RTCIT) en de muis inenting test (MIT), vereisen enkele dagen6, een groot nadeel wanneer een snelle diagnose van essentieel belang is.
Diverse moleculaire kenmerkende tests (b.v., de opsporing van viraal RNA door RT-PCR, PCR-enzym-verbonden immunosorbent assay [PCR-ELISA], in situ kruising, en PCR in real time) worden gebruikt als snelle en gevoelige technieken voor hondsdolheid diagnose8. RT-PCR wordt nu geadviseerd door OIE voor routine hondsdolheid diagnose, en een heminested (hn) PCR wordt beschreven in het OIE handboek van kenmerkende tests en vaccins voor aardse dieren om al lyssaviruses5te ontdekken. Hier beschrijven we een pan-Lyssavirus geneste RT-PCR, die het mogelijk maakt de specifieke en gevoelige detectie van alle 18 Lyssavirus soorten vergelijkbaar met of hoger dan die verkregen door het vet. Het principe van de methode is een RT van het doel RNA (geconserveerd gebied van het Lyssavirus N gen) in cDNA, gevolgd door de versterking van de cDNA door twee rondes van PCR. De cDNA ondergaat de eerste ronde PCR met buitenste primers om een 845 BP fragment te versterken; dan, gebruikt tweede-ronde PCR het eerste-ronde PCR product als malplaatje om een 371 BP fragment met binneninleidingen te versterken. De twee rondes van PCR verhogen beduidend de gevoeligheid van de analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Momenteel, is RABV een belangrijke Lyssavirus verantwoordelijk voor bijna al menselijke en dierlijke hondsdolheid in China, evenals in andere landen. Bovendien werd een IRKV variant eerst geïdentificeerde van a Murina leucogaster knuppel in de provincie Jilin in noordoostelijk China in 201210, en het is gemeld om de dood van een hond in de provincie Liaoning in 201711te veroorzaken. Onlangs, werd een roman Lyssavirus, TWBLV, ook geïdentificeerde van een …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studie werd gesteund door het nationale belangrijkste onderzoek en ontwikkelings plan (toelage nr. 2016YFD0500401) en de nationale stichting van de natuurwetenschappen van China (toelage nr. 31302043).
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
- Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).
- Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. , 74-195 (2018).
- Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
- Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).
- Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).
- Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).
- Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).
- Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).
- Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).
