Ionenwisselingschromatografie (IEX) gekoppeld aan meerdere hoek lichtverstrooiing (MALS) voor eiwit scheiding en karakterisering

1. bereiding van het systeem De snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) systeem en MALS/refractieve index (RI) detectoren (Zie Tabel van materialen) samen met hun respectievelijke softwarepakketten voor controle, data-acquisitie en analyse per de fabrikanten installeren instructies. Sluit de MALS en RI detectoren stroomafwaarts van de FPLC van UV- en geleidbaarheid detectoren. De pH-detector omzeilen tenzij het absoluut noodzakelijk is voor pH verlopen, tot een minimum beperken van het interdetector volume tussen de UV en MALS detectoren. Gebruik van de capillaire buis van 0,25 – 0,5 mm binnendiameter (i.d.) tussen de kolom en detectoren en 0,75 mm i.d. capillaire buis op de uitgang van de detector van de RI aan de verzamelaar afval of breuk. Ervoor zorgen dat de nodige signaal verbindingen tussen de FPLC en de detectoren zijn vastgesteld, met inbegrip van een UV analoge uitgang van de detector van de FPLC op de MALS Aux ingang en digitale uitgang van de FPLC naar de MALS Autoinject, via de i/o-Box. 2. bereiding van het monster en de buffer Filteren alle reagentia, met inbegrip van het wassen en elutie buffers, met een 0.1 µm filter. Filtreer de eerste 50-100 mL buffer in een afval fles teneinde op te heffen deeltjes uit de droge filters, en houden de rest van de buffer in een schone, steriele fles die is grondig gewassen met gefilterd water en afgetopt om te voorkomen dat stof invoeren. Een BSA monster een pH en Ionische sterkte aanpassen (bijvoorbeeld pH = 8, 50 mM NaCl) dat binding aan de IEX kolom toestaan tijdens verdunning, ultrafiltratie of buffer uitwisselingsprocedures.Opmerking: Het wordt aanbevolen om de eiwitSteekproef op de kleinste poriegrootte die niet het materiaal van belang verwijdert voorfilter (0.02-0.1 µm). Anderzijds kan het monster worden gecentrifugeerd met hoge snelheid (13.000 – 16.000 x g) gedurende 10 minuten om het neerslaan van grote deeltjes. Bereiden van ten minste 0,3 – 0,5 mg van BSA (Zie Tabel van materialen) te injecteren in een kolom van 1 mL (5/50 mm) voor het bereiken van een goede kwaliteit MALS analyse. Merk op dat het volume van de injectie onbeperkt is. 3. de keuze en ontwikkeling van een methode van de IEX voor een eiwit Bereken het elektrisch punt (pI) van het eiwit op basis van de primaire volgorde, voor welke servers zoals hulpmiddel van de Protparam op de ExPASy website gebruikte15kan worden. Merk op dat de pI van BSA 5,8. Selecteer de kolom type en buffer parameters. Gebruik verschillende buffers voor AIEX en CIEX, afhankelijk van de pKeen van de buffer en de Ionische aard van de buffer. Kationogene buffers gebruiken bij het uitvoeren van de AIEX kolom en anionogene buffers bij het uitvoeren van de CIEX-kolom met kleine counterions. In dit voorbeeld gebruiken 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8, voor de analyse van de BSA van een AIEX kolom. Voor een eiwit met een pI lager dan 7, zoals BSA, AIEX kolom en buffer met een pH hoger dan de pI door ten minste twee eenheden te gebruiken. Voor een eiwit met een pI hoger dan 7, een CIEX kolom en de buffer met een pH lager dan het eiwit pI door ten minste twee eenheden te gebruiken. Optimaliseren van de pH van de buffer volgens de sterkte van de binding tussen het eiwit en de kolom-matrix. Als een eiwit niet goed naar de kolom bindt, gebruikt u een pH verder van de pI. Zorg ervoor dat het eiwit stabiel bij de gebruikte pH is. Gebruik een lage zoutconcentratie in de binding en wassen van de buffers zodat binding van het eiwit naar de matrix, omdat de binding aan eiwitten is afhankelijk van de Ionische sterkte van het geladen monster. Eiwitten vereisen gewoonlijk wat zout voor hun stabiliteit; Daarom gebruiken 50 mM NaCl (of alternatieve zout) tijdens de eiwit-laad- en kolom-wassen stappen. Voor de elutie buffer, kunt een maximum van 0,5 M NaCl loskoppelen van de proteïne van de kolom.Opmerking: Hogere concentraties van zout worden niet aanbevolen bij het werken met de standaard-model RI refractometer als gevolg van de beperking van het bereik van het instrument. Echter, een hoge concentratie-model kan worden gebruikt en geschikt is voor 2 M NaCl. Een eerste methode als volgt uitvoeren. Laden van 1 mg van BSA (170 µL van 6 mg/mL) in mL van de ~0.5 van de buffer van een lading van 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8, bevattende 50 mM NaCl. Was de kolom met de dezelfde buffer voor een 10-15 kolom volume (CV) om de volledige elutie van de niet-afhankelijke moleculen en deeltjes uit het systeem tot de verstrooiing van licht (LS), UV, en RI signalen zijn volledig gestabiliseerd. Voer een korte, lineaire zout gradiënt van 20-30 CV, met behulp van elutie buffer van 20 mM Tris-HCl, pH 8, bevattende 0,5 M NaCl als u wilt loskoppelen van de proteïne van de kolom. Uitvoeren van een helling van 0-100% (of alternatieve wijdverbreide verloop) van de buffer van de elutie of splitsen aan twee verlopen: 0%-50% van de elutie buffer gevolgd door een extra verloop van 50% – 100% van elutie buffer, elk verloop voor 10 – 20 CV. Voor BSA, gebruikt u een brede helling van 15%-70% voor 30 CV voor de eerste methode.Opmerking: In sommige gevallen, de eerste methode kan bieden scheiding voor een betrouwbare analyse van MALS, en extra punten zijn niet nodig. In veel gevallen biedt de eerste methode slechts richtsnoeren voor de verdere optimalisering van de methode. Optimaliseer de IEX-methode voor het verhogen van de resolutie en de piek scheiding te verbeteren door verschillende parameters te wijzigen. Wijzig de kleurovergang helling en lengte. Korte hellingen met hoge hellingen bieden intensieve pieken met minder scheiding, terwijl lange hellingen met milde hellingen lagere pieken met betere scheiding bieden. Evenwicht vinden tussen piek resolutie en signaal intensiteit voor optimaal MALS analyse.Opmerking: LS, UV, laden van een hogere hoeveelheid eiwitten kan verhogen en RI signalen maar wel ten koste van de resolutie. Een stapsgewijze zoutconcentratie profiel gebruikt voor de elutie. Vergeet niet dat een combinatie van stappen en lineair verloop wordt vaak gebruikt. Het verlagen van het debiet ter verbetering van de piek scheiding.Opmerking: Voor matrices met zeer kleine deeltjes, dit is niet zeer belangrijk. Het wijzigen van de pH van de buffer te verhogen van de variatie van de kosten tussen de populaties van de eiwitten in de steekproef en de scheiding tussen deze varianten te verbeteren. Opmerking dat eiwitten die zijn niet goed bij een pH gescheiden kunnen worden gescheiden met een verschillende pH. Gebruik een pH verloop, lineair of stapsgewijze, loskoppelen van de eiwitten uit de IEX-kolom. Gebruik elutie verlopen die combineren zowel pH als zoutconcentratie variaties indien nodig. Gebruik sterkere zouten, zoals MgCl2of zwakkere zouten, zoals Natriumacetaat, het verhogen van de gevoeligheid en de resolutie van16. Gebruik langer IEX kolommen of een andere kolom matrix met kleinere deeltjes te verbeteren van de capaciteiten van de scheiding. Het wijzigen van het type kolom (AIEX/CIEX) om een ander patroon van scheiding. Merk op dat matrices met sterke, zwakke of gecombineerde (gemengde modus) liganden ook beschikbaar zijn en de resolutie van enkele monsters kunnen verbeteren. Een kolom van een andere leverancier gebruiken met de dezelfde ligand die is gekoppeld aan verschillende matrix harsen. De hars zelf, onafhankelijk van het ligand, kan anders communiceren met de eiwitten en invloed op het profiel van de scheiding. Additieven (moleculen die de proteïne in de oplossing te stabiliseren) opnemen in de buffers te verbeteren van eiwitstabiliteit en vermijden van aggregatie van eiwitten, ter verbetering van de IEX-experiment.Opmerking: Voorbeelden van dergelijke additieven zijn suikers, nonionic of zwitterion detergenten, alcoholen, ureum en zouten van chaotropic en kosmotropic17,18. 4. IEX-MALS experiment Open New\Experiment van methode in de MALS-software en selecteer de online methode van de map van de methoden van het systeem van Licht verstrooiing . Als de DLS-module beschikbaar is en DLS gegevens moeten worden overgenomen, schakelt u de online methode uit de submap Licht Scattering\With QELS . De parameters van de run instellen onder de configuratiesectie . Instellen van het debiet van de run in de sectie Algemene pomp de stroomsnelheid gebruikt in de FPLC (1,5 mL/min), en voer of Controleer of de parameters van de buffer onder de sectie van het oplosmiddel . Voer de naam in eiwit (BSA), brekingsindex (dn/dc, de standaard waarde voor eiwitten is 0,185 mL/g), UV uitsterven coëfficiënt bij de golflengte van 280 nm (0,66 g/L-1•cm-1), en de concentratie van het eiwit monster (6 mg/mL) in het tabblad voorbeeld onder de sectie van de Injector . Het monstervolume voor injectie (170 µL) evenals onder dezelfde sectie invoegen In het tabblad Basic collectie onder de sectie van de Procedure , Vink het selectievakje Trigger op Autoinject en stel de duur van de vlucht zodat gegevensverzameling zal worden voortgezet gedurende ten minste 5 minuten nadat het verloop heeft bereikt zijn verkoopcommissie. Het experiment parameters instellen in de FPLC-software. Maak een nieuw experiment in het tabblad Method Editor . Het eerste experiment zullen een lineair verloop van zout of pH (zie stap 3.3). Voor de geoptimaliseerde methode, maakt een meer specifieke verloop- of een stapsgewijze programma volgens de elutie resultaten tijdens de eerste methode (zie stap 3.4 en Figuur 1). Een puls signaal in de methode die leiden de verzameling van de gegevens in de MALS-software tot zal opnemen. Wassen van de kolom en kleppen met de relevante buffers: 20 mM Tris-HCl, pH 8, met 50 mM NaCl voor het wassen buffer (een klep) en de dezelfde buffer met 500 mM NaCl voor de elutie buffer (B valve). Zorg ervoor dat de laatste kolom-wash de bindende buffer, met een lage zoute concentratie, gebruikt om de binding van het eiwit op de kolom-matrix. Gebruik voor een massale wassen van sterk gebonden onzuiverheden, 0,5 M NaOH vóór het wassen met de relevante buffers, gevolgd door een neutralisatie buffer wassen. Leg het monster van eiwit in de lus met een injectiespuit. Als meer dan 10 mL van het monster is geladen, gebruikt u een superloop of de pomp-klep van de FPLC instrument terwijl het omzeilen van de filter pomp en de mixer van de FPLC. Het experiment eerst starten in de MALS-software door te klikken op de knop uitvoeren , en vervolgens in de FPLC-software. Gegevens zal gebeuren na ontvangst van het signaal van de pols van het instrument van de FPLC via de detector MALS. Dezelfde parameters van de run en de instructies beschreven in stap 4.1-4.4 als de IEX-MALS handmatig is uitgevoerd met een continue-stroom-modus in plaats van een zelfstandige methode toepassen. Zodra de laatste methode is gecontroleerd en uitgevoerd, precies dezelfde methode met behulp van een lege injectie (laden buffer in plaats van het monster) uitvoeren Het is belangrijk dat de timing tussen de autoinject pols en het verloop van de lege run identiek aan die van het monster uitgevoerd is. 5. analyse van experimentele gegevens van IEX-MALS De analyses stap voor stap onder de sectie van de Procedure in de MALS-software uit te voeren. De Basic collectie weergave het verzamelen van de ruwe gegevens van het experiment. Gebruik het tabblad Despiking de chromatogrammen glad als ze een heleboel lawaai vertonen. Normaal gesproken gebruiken het normale niveau. Definiëren van de basislijn voor alle signalen (alle LS, UV en RI detectoren) volgens de basislijn . De pieken voor analyse in de pieken weergave definiëren. Controleer of de juiste waarden van dn/dc en de UV-uitsterven-coëfficiënt voor het eiwit onder elke piek.Opmerking: Voor eiwitten, het is gebruikelijk om het gebruik van een standaard RI increment-waarde van 0,185 mL/g, maar voor andere macromoleculen, verschillende dn/dc waarden gebruikt moeten worden, volgens de aard van het molecuul. De gemiddelde dn/dc van polynucleotiden (DNA/RNA) is 0,17 mL/g19, terwijl sacchariden, zoals sucrose, een gemiddelde dn/dc-waarde van 0.145 mL/g-20 en de dn/dc waarden van lipiden en detergenten bereik tussen 0.1 – 0.16 hebben mL/g21. Analyseer de molaire massa en de straal met behulp van de montage-parameters en de correlatiefunctie onder de weergaven molaire massa en straal van LS en Rh uit QELS . De RI-signaal veranderingen aanzienlijk tijdens de IEX-MALS uitgevoerd als gevolg van de toename van de zoutconcentratie. Daarom aftrekken het signaal van de basislijn van de lege injectie voor massale berekeningen die RI gegevens nodig. Open zowel het eiwit als de lege IEX-MALS experimenten. Klik met de rechtermuisknop op de naam van de eiwit-experiment, selecteer Methode toepassenen de Basislijn aftrekken map kiezen uit het bestandsdialoogvenster. Selecteer het juiste type (bijvoorbeeld online) methode voor standaardanalyse molaire massa. Merk op dat de parameters en instellingen die zijn gedefinieerd voor de eiwit-experiment zal worden opgeslagen op de nieuwe open methode. Onder de Basislijn aftrekken weergave, klikt u op Lege importeren als u wilt importeren van de signalen van de lege run. Controleer onder instrumenten (naast de Import lege knop), alle van de detectoren aftrekken. In de weergave pieken waardecorrecties op dn/dc (indien nodig) als gevolg van de geleidbaarheid van de oplossing bij het eiwit piekoppervlakte, aangezien de RI van de oplossing wordt gewijzigd tijdens de uitvoering12. Kalibreer het systeem van de IEX-MALS met BSA monomeer.Opmerking: Normaal gesproken het IEX-MALS-systeem wordt regelmatig gekalibreerd voor piek uitlijning, verbreding van de band en de normalisatie van de hoekige detectoren naar de detector van de 90° met behulp van een monodispers eiwit met een straal van traagheidsstralen (Rg) van < 10 nm, zoals BSA monomeer. In dit voorbeeld, BSA serveert zowel als de kalibratie-molecuul en is zelf het onderwerp van de molaire massa analyse. Uitlijnen van de toppen, volgens de Procedures > configuratie weergeven. Uitvoeren van normalisatie onder de weergave van de normalisatie , invoeren van 3.0 nm als de R-g -waarde. Selecteer onder Verbreding van de Band in het zelfde lusje van de configuratie , de piek en overeenkomen met de UV- en LS signalen aan het RI-signaal, met behulp van de knop Uitvoeren passen . De grafiek van de resultaten wordt weergegeven in de weergave Resultaten passend . De as-schalen en andere parameters van de grafiek wijzigen door met de rechtermuisknop op de grafiek, selecteren, bewerkenen vervolgens op de knop Geavanceerd te klikken. De figuur van een grafiek met meer weergaveopties is ook beschikbaar in het tabblad EASI grafiek : Selecteer Molaire massa van het drop-down-menu weergeven boven aan het venster. Merk op dat alle resultaten, met inbegrip van de molaire massa, straal, niveau van zuiverheid en anderen, vindt u in de rapportweergave (beknopte of gedetailleerde) onder het gedeelte ‘ resultaten ‘ . Gebruik de Report Designer knop meer resultaten of parameters, evenals cijfers, aan het rapport toevoegen.