Bireysel Autoreactive Germinal merkezleri Photoactivation otoimmünite, karışık Chimeric modeli tarafından sorguya

Tüm hayvan kullanımı Avrupa toplum kuralları için standartlarla uyumlu ve Danimarka hayvan araştırma Müfettişliği (2017-15-0201-01348) tarafından kabul edildi. 1. genel fare yetiştiriciliği ve arabellekleri ve araçları hazırlanması Ev faresi çizgiler standart esaslarına göre Sağlık durumunun periyodik izleme ile belirli patojen ücretsiz (SPF) koşullar altında. İsteğe bağlı: spontan germinal merkezleri tarafından izlenen adventif enfeksiyonlar nedeniyle saf farelerde yokluğu doğrulayın. Bu ayirt mikroskobu (germinal Merkez yapıların varlığı) tarafından yapılabilir veya Akış Sitometresi (frekans germinal Merkez B hücre) yukarıda açıklanan12olarak.Not: Her iki kadın ya da erkek-ebilmek var olmak kullanılmış. Genellikle bir uyumsuzluk seks teorik olarak doğru erkek Y-antijen alloreactivity kadın alıcıları/bağış15tarafından yol açabilir gibi seks maç bağış ve alıcıların, ideal budur. Kullanım CD45.1 alıcılar (B6. SJL -Ptprcbir Pepcb/BoyJ), yaklaşık 6-10 hafta-in yaş. 564Igi kullanın (B6. Cg-Ightm1 (Igh564) TikIgktm1 (Igk564) Tik/J) ve PA-GFP (6-12 hafta-in yaş, B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) bağış. Cerrahi alet (düz iyi makas ve Dumont forseps #5 ve #7) tarafından ısıyla sterilize rutin sterilizasyon esaslarına göre onları. Kemik iliği (BM) arabelleği içeren fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), %2 Fetal sığır Serum (FBS), 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH 7.4 500 mL hazırlayın. BM arabellek hazırlamak için ısı inaktive (1 saat içinde tamamlayıcı devre dışı bırakabilirsiniz için 56 ° C su banyosu) 10 mL ekleyin FBS ve 1,25 mL (pH 7.4 düzeltilmiş) 400 mM EDTA çözeltisi PBS, pH 7,4 ve mix iyi 500 ml. 0.2 µm filtre kabı kullanarak arabellek filtre. Kırmızı kan hücre (RBC) lizis arabellek (155 mM NH4Cl, 12 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA) 10 mL reaktif sınıf su ile toplam hacminin 10 ml 10 x stokunun 1 mL sulandrarak hazırlayın. PBS 50 mL 5 mM EDTA, pH 7.4 ile hazırlayın. 2. karışık kemik iliği chimeras kurulması Işınlama alıcıların (0 gün) CD45.1 kemik iliği alıcılar bir uygun ışınlama kapsayıcısına getirin ve 1100 ile ışınlatayım gama irradiator Rad.Not: Alternatif ışınlama kaynakları kullanılabilir. Ne olursa olsun kaynak, doz/zamanlama maksimal myeloablative etkisi en az teminat doku hasarı ile hayvanlar için verim için optimize edilmiş olması gerekiyor. Antibiyotik su (1 mg sulfadiazin ve trimetoprim/mL içme suyu 0.2 mg) ad libitum yerleştirin. Ayıklama kemik (gün 1) %4 isoflurane havada, sürekli akış tarafından 564Igi kemik iliği bağış anestezi ve servikal çıkığı tarafından ötenazi. Etanol ile bağış aşağı sprey ve steril cerrahi yastıkları akışı başlıklı üzerine koyun. Steril koşullarda, steril tamponlar ve ekipmanlar kullanarak Bakımı çalışmaya devam edin. Femur ve tibia ayıklamak için ilk bileklerinden bir kesi yapmak ve yukarı doğru düz iyi makas kullanarak kalça sonuna kadar genişletme. Ağır bir forseps veya başparmak ve işaret parmakları kullanarak, cilt ve vücut doğru bacak kapalı çekin. Benzer şekilde cildi aşağı ve ayak uzakta çekin. Diz ve ayak bileği eklem pop bacak, kalça kapma ve ayak zorla çekerek. Ayak bileği eklem break ve böylece tendon ve kas tibia off sıyırma tibia tutarken ayak vücut doğru çekmek için devam edin. Diz sürümü tibia için ortak break ve benzer şekilde bunu böylece tendon ve kas uyluk kemiği off sıyırma uyluk tutarken doğru beden çek. Bir kesik Kalça eklemi yapmak ve tendonlar kesebilir ve sonra uyluk kemiği kalça soketten dışarı çekin. 2.2.2-2.2.4 kontralateral tarafı için yineleyin. Kemikleri dikkatle onları tüm kalan kas ve bağ dokusu kaldırmak için bir kaba kağıt havlu ile sürtünme temizleyin. Sonra nihayet taze soğuk BM arabelleğe Dumont #7 forseps bir çift kullanarak buza aktarmadan önce buz gibi BM arabellekte yıka. 2.2 PA-GFP bağış için yineleyin.Not: Kemik iliği hücreleri tek bir donörden cinsiyet ve yaşa göre değişir. Ölçek bağış İstenen giriş kemik iliği oranları ve numaraları göre sayısı ve istenen alıcı sayısı. Eğer bağış kıt, ön bacaklarda kemik iliği çıkarma için dahil edilebilir. Bu genellikle bir ek 1/3 ½ hind uzuvların elde edilen hücre üretir. Genellikle, her yerde 50-200 milyon hücrelerden başına donör, yaş, cinsiyet, arka plan ve sadece arka veya hem arka ve ön bacaklarda dahil olup bağlı olarak elde edilebilir. Kemik iliği hücre çıkarma Buz gibi BM arabellekte durulama tarafından harç hazırlayın. Durulama arabellek drenaj ve bir elektrik pipet denetleyicisi bir 10 mL serolojik pipet ile 10 mL taze buz gibi BM arabellek eklemek için kullanın. Kemikleri 564Igi bağışçılardan Dumont #7 forseps bir çift kullanarak harç transfer edecek ve havaneli ezmek ve kemik iliği serbest bırakmak için kemikleri çektirmek için. Kemik iliği özü bir 10 mL serolojik pipet ile Aspire edin ve buz üzerinde 50 mL tüp içine 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçer. Taze buz gibi BM arabellek ek bir 10 mL için harç ekleyin ve hücre tam kurtarma sağlamak için yineleyin. Harç bir kağıt havlu ile kemik malzeme kaldırmak, uygun şekilde atın ve dikkatle % 70 etanol BM arabellek tarafından takip, harçla durulayın. 2.3 PA-GFP kemik iliği donör grubu için yineleyin. Kemik iliği Hücre sayımı Bir micropipette kullanarak, RBC lizis arabelleği plastik parafin film bir parça üzerinde 40 µL içeren bir damlacık yerleştirin. 564Igi kemik iliği tüp birkaç kez ters çevir ve 10 µL bir micropipette kullanarak aliquot al. RBC lizis arabellek bırak 40 µL ile karıştırın. Daha sonra Trypan mavi (sulu çözelti içinde % 0,4) 50 µL için açılan ekler. Hemen bir Burker-Türk hemasitometre ve mikroskop altında sayısı alanındaki elde edilen karışımı 10 µL yükleyin. Kullanarak toplam seyreltme faktörü x 10 mL başına hücre sayısını hesaplayın. Yeterli hücre canlılığı Onayla > % 90. 2.4 PA-GFP kemik iliği donör grubu için yineleyin. Donör süspansiyonlar hazırlanıyor Adım 2.4 ve alıcılar için istediğiniz sayıyı elde sayar dayanarak, donör kemik iliği bağışı mix tüpte karışık olması iki donör grubun her birinden hacmi hesaplamak.Not: Örneğin, 1:2 karışık 564Igi:PA bir grubunun kurulması-6 CD45.1 alıcılı GFP chimeras: her alıcı için 20 x 106 donör hücreleri toplam, 1 Bölüm 564Igi ve 2 parça PA-GFP. Böylece, bu 6 x 1/3 x 20 x 10 gerektirir6 40 x 106 564Igi donör hücreleri ve 6 x 2/3 x 20 x 10 =6 = 80 x 106 PA-GFP donör hücre. PA-GFP ve 564lgi donör kemik iliği 50 mL konik tüp içinde uygun miktarda karıştırın. Kemik iliği karışım 200 g ve 4 ° C x 10 dakika sallanan bir kova rotor kullanarak santrifüj kapasitesi. Süpernatant dikkatle boşaltmak ve buz gibi BM arabellek mL başına 1 x 108 hücre yoğunluğu, hücrelerde resuspend. Precooled 1.5 mL microcentrifuge tüp buza aktarın. Kemik iliği alıcılarla başlamaktan donör kemik iliği Anestezi indüksiyon ile % 4 isoflurane bakım %3,75 ardından, havada, sürekli akış kullanan alıcılar. Anestezi yeterli uçak toe-çimdik refleks yokluğunda tarafından doğrulayın. Dikkatli kemik iliği hücrelerinin yeterli resuspension, o zaman aspiratı 200 µL 0.3 ml (~ 20 x 106 hücreler), kemik iliği karışımı sağlamak için kemik iliği karışımını içeren tüp tekrarlarsam, insülin şırınga 30 ölçmek. Alıcı onun yanına koyun, yavaşça cilt üzerinde ve biraz ‘göz dışarı pop için ‘ göz altında germek ve yavaşça şırınga ucu yaklaşık 30 ° açıyla göz ve çevreleyen doku önlemek için dikkat çekici göz çukuru ön içine yerleştirin. İğne ucu göz çukuru altını kemik dokunmak hissettiğinde, biraz geri çek (~0.5 mm) ve yavaş yavaş donör kemik iliği sabit basınç kullanarak enjekte.Not: Orada kanama yok, sıvı ve Hayır çok küçük şişkin göz üzerine enjeksiyon için hiçbir sızıntı olmalı. Belgili tanımlık kafes ad libitum antibiyotik su ile fare dönmek ve acil kurtarma yordamı doğrulayın. 2.6 her alıcı için yineleyin.Not: Kuyruk-damar enjeksiyon retroorbital enjeksiyon ile benzer sonuçlar yerine kullanılabilir, ancak, bizim elimizde hangi-ebilmek var olmak bir endişe alıcılar büyük gruplar ile çalışırken seçilmesinden çok daha yavaş. Bir aspirasyon ve boğulma riski oluşturduğu kurtarma doğrudan üzerinde küçük çaplı yatak anaesthetized hayvanların kaçınılmalıdır Antibiyotik su (gün 14) kaldırma Antibiyotik su cage(s) kaldırın ve normal içme suyu ile değiştirin. 3. başarılı sulandırma kontrol ve chimerism (hafta 6) uygun ölçüde doğrulanıyor Chimeras ve kontrol Retroorbital kanama Kan toplama tüpler 1.5 mL microcentrifuge tüpler alıcı kulak etiketi numaraları göre etiketleme ve 5 mM EDTA içeren PBS 50 µL ekleme hazırlamak.Not: PA-GFP, CD45.1 ve CD45.2 ve 9 d 11 (idiotype) için uygun denetimler içerir. Bu 1 ekleyerek yapılabilir PA-GFP + fare, 1 CD45.1 fare, 1 B6 fare ve 1 564Igi fare. Fareler anestezi ve anestezi adım 2.6.1 olduğu gibi yeterli uçak doğrulayın. Chimera onun yanına koyun, yavaşça cilt üzerinde ve biraz ‘göz dışarı pop için ‘ göz altında germek. Yavaşça bir BoPET sarılmış heparinized kılcal tüp (60 µL iç hacim) yaklaşık 40 ° açıyla göz ve çevreleyen doku zarar görmesini önlemek için dikkat çekici göz çukuru ön içine yerleştirin. Yavaşça twist/tüp kan ile doldurmak başlayana kadar döndürün. Pasif tüp kılcal eylemle, neredeyse tamamen dolu kadar doldurmak için kan izin sonra tüp geri çekmek ve aynı zamanda hemen kavrama göze izin vermek için göz çevresinde rahatlatıcı karşılık gelen önceden etiketli toplama tüp içine yerleştirin pozisyon içine yerleşmek. Kanama hemen durdurmanız gerekir. “Sharps” kap içinde atmak ve kılcal tüp toplama tüp içine boşalttı emin olun. Tüp kapatın ve tam PBS/EDTA ile karıştırma sağlamak için üç kez tersine çevirin. Fare kafes dönmek ve acil kurtarma yordamı doğrulayın. 3.1 deneysel her fare ve uygun denetimler için adımları yineleyin.Not: Bunlar tamamen yeniden önce bu yöntemi adventif enfeksiyon radyoaktif alıcılar için daha büyük bir risk oluşturabilecek gibi submandibular ven ponksiyon kullanırken dikkatli olun. Ayrıca, deneyim, biz toplanan kan kan hacmi ve aşırı kanama nedeniyle kayıp kan miktarını daha fazla değişkendir bulabilirsiniz. Kemik iliği chimeras sulandırma aşamasında hassas olarak önce yeni kemik iliği tamamen engrafted ve hematopoiesis normal düzeyleri devam ediyor bu hususlar her ikisi de önemlidir. Periferik kan mononükleer hücre (PBMC) arıtma Kan toplama, kısaca tamamlanmasından sonra (10 s) düşük hızda tüpler santrifüj kapasitesi (< 200 x g) seyreltilmiş toplamak için stabilize kan tüpleri dibinde. Bir 10 mL şırınga lenfosit ayrılık orta ile doldurun ve bir 18 G iğne ekleyin. İlk tüp altına iğne takın ve kan örneği ile 1 mL lenfosit ayrılık orta underlayer. Dikkatle iğne çekilme ve Çapraz bulaşma sonraki örnek önlemek için kağıt havlu ile silin. Tüm örneklerini devam sonra 800 x g, oda sıcaklığında, sallanan-kova santrifüj 25 dakika santrifüj kapasitesi frene düşük/kapama için ayarlayın. Buna bağlı olarak etiketli 1,5 mL birtakım buz gibi BM arabelleği 1 mL içeren microcentrifuge tüpleri hazırlayın. Her örnek için aşağıdaki Santrifüjü 200 µL micropipette üst (plazma) katmanla girin ve hemen üstünde belgili tanımlık arayüzey mononükleer hücre (MNC) katmanı Aspire edin. Hücreleri içeren 1 mL BM arabelleği buna bağlı olarak etiketli tüp aktarın. Kapağı kapatın ve karıştırmak için tersine çevirin. Lenfosit ayrılık orta içeren tüp atmak. 200 x g 5 min, sallanan bir kova Open End 4 ° C için de santrifüj kapasitesi ve tüm örnekleri ile devam edin. Aspire edin ve süpernatant atın ve Pelet buz gibi BM arabellek 200 µL içinde resuspend. Örnekleri antikor boyama ve akış sitometrik çözümlemesi için hazırsınız. Akış sitometrik değerlendirme için boyamaNot: panel önerdi: CD45.1-FITC, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A568, CD45.2-APC. Sigara aktif PA-GFP Pasifik turuncu (veya eşdeğer) kanal algılanır. Lenfosit ayrılık ölü hücrelerden kurtulur hiç canlılığı boya gerekmemektedir. Bir micropipette kullanarak hücre süspansiyon her chimera ve denetim örnek için iyi başına 100 µL 96-şey plakasına ekleyin. 3 sigara-PA-GFP kontrol örnekleri için her örnek (300 µL toplam) kalan 100 µL havuz. Günahı kontrol ve kumanda lekeli kuyu bu malzemenin 50 µL ekleyin. PA-GFP tek lekeli denetimi için Ayrıca 50 µL günahı PA-GFP örneği ekleyin. Her şey (günahı) arabelleği 100 µL eklemek için tek antikor (PA-GFP tazminat denetim dışında tek lekeli tazminat denetimleri) veya antikor mix (örnekler). Buz üzerinde 20 dakikadır kuluçkaya. De 200 x g 4 ° C’de 5 dakika santrifüj kapasitesi Arabellek hafifçe vur. Her şey için BM arabelleği 200 µL ekleyin ve tekrar yıkamak için santrifüj kapasitesi. Arabellek fiske ve BM arabelleği 200 µL her kuyuya hücrelerde resuspend. Örnekleri bir Akış Sitometresi (şekil 1) çözümleme için hazırsınız.Not: Chimeras Germinal Merkez yanıtlarında herhangi bir noktadan itibaren 6 hafta, analiz edilebilir. 4. In vivo tek germinal merkezleri tanımlaması yardım için marjinal bölge/subkapsüler sinüs etiketleme Not: Mevcut protokol footpad/hock (popliteal lenf nodu) ve şarapla (damar yolu, dalak) enjeksiyonları için gösterilmiştir, ancak hedef siteye göre değiştirilebilir. Popliteal lenf nodu etiketleme için ikili footpad enjeksiyon Fareler gibi adım 2.6.1 anestezi. 1.5 mL microcentrifuge tüp 2 µL PE etiketli fare Anti-fare CD169 antikor 18 µL PBS, pH 7.4 oranında seyreltin. Karışımı 10 µL her iki damlacıkları plastik parafin film bir parça yerleştirin. 0.3 mL insülin ile 30 gauge iğne kullanarak her damlacık Aspire edin. Mix’a footpad etiketleme 10 µL enjekte (footpad, ayak parmakları, başından itibaren proksimal orta kısmında bir 5-10 ° açıyla iğne ile girin ve iğne topuk doğru yaklaşık yarım Ekle) veya hock (iğneyle bir 5 – at girin 10 ° açı sadece topuk ve hakkında eklemek yarıya kadar diz doğru yönde Aşil tendonu eksen boyunca onun uzunluğu). Fareler için onların kafes dönmek ve adım 5 işlemine devam etmeden önce yaklaşık 15 dakika bekleyin. Dalak etiketleme için intravenöz enjeksiyon Fareler gibi noktası 2.6.1 anestezi. 1.5 mL microcentrifuge boru PE etiketli fare Anti-fare CD169 antikor PBS 90 µL içinde 10 µL sulandırmak. Karışım 0.3 mL insülin şırıngayla Aspire edin. Retroorbital IV enjeksiyon adım 2.6 göre gerçekleştirin. Fareler için onların kafes dönmek ve adım 5 işlemine devam etmeden önce yaklaşık 15 dakika bekleyin.Not: Alternatif olarak isoflurane, ketamin/Xylazine karışımı kullanılan gibi anestezik enjeksiyon; Ancak, bu genellikle daha yavaş süreleri için yol açar. Lenfatik drenaj genellikle iskelet kas hareketi tarafından etkilenir olduğundan, bu yavaş drenaj zaman kurşun bekleniyor. 5. explanting dalak ve lenf bezleri ve photoactivation için hazırlanıyor Çift taraflı görüntüleme ve photoactivation odası hazırlama Pistonu 20 mL şırıngadan çıkarın ve geri-Bu vakum yağ ile bir tüp vakum yağ meme içine ekleyerek yük. Daha sonra pistonu 5 mL şırıngadan çıkarın ve geri-Bu vakum yağ ile yük için 20 mL şırınga kullanın. Bir kare coverslip düz bir yüzeye yerleştirerek ve vakum yağlı (yaklaşık 1-2 mm kenarlarından) coverslip kenarları boyunca izleme tarafından görüntüleme ve photoactivation odası hazırlamak için vakum-yağ yüklü 5 mL şırınga kullanın.Not: microdroplets vakum yağ daldırma su emülsiyon objektif kontamine gibi daha sonra mikroskop objektif temas gelen tüm yüzeylerin vakum yağ kirlenmesini önlemek için dikkat ediniz. Kapak kaymaz vakum yağ odası buz gibi BM arabelleği ile doldurmak ve soğuk düz bir yüzeye yerleştirin. Lenf düğümleri ve dalak hasat İçinde vivo chimeric fare 2.2.1 adım başı olarak çözümlenmesi için etiketli ötenazi. Karkas % 70 etanol ile aşağı sprey. Popliteal lenf düğümü’ne erişmek için diz çukuru altında sadece deride bir kesi yapmak için düz iyi makas kullanın ve hamstring hattı boyunca yukarı doğru kesme neredeyse Kalça eklemi kadar uzatmak. Dumont #5 veya #7 forseps kullanarak, her cilt dışarı doğru popliteal fossa (şekil 2A) dokusunda ortaya çıkarmak için maruz kanatları çekin. Dumont #5 forseps bir çift kullanarak, dikkatle popliteal fossa sadece medial popliteal ven girin ve incelemek ekleme ve açma ve temel popliteal lenf nodu göstermek bacak, ekseni boyunca forseps kapatma yağ açın. Fessalar dışında lenf nodu kuadriseps kas başparmak ve işaret parmağı (şekil 2B) kullanarak diz proksimal ön taraftan pinching tarafından pop. Çevre dokudan (şekil 2C) kurtarmak ve 5.1 adımda hazırlanan vakum yağ odası yer için Forseps ile aşağıdan lenf nodu bul. 5.2.2-5.2.4’ten kontralateral tarafı için yineleyin. Birden fazla lenf düğümleri tek bir odasında istenirse takılabilir. Sonunda odası ikinci coverslip vakum yağ RIM üstüne yerleştirerek ve yavaşça aşağı, tüm hava kabarcıkları A’ya kulak tuşuna basarak kapatın.Not: Bazı arabellek de itilmiş ama vakum yağ kaçağı sıvı (şekil 2B) önlenmesi sıkı bir mühür oluşturmalıdır. Lenf düğümleri çift taraflı bir görüntüleme odasında oldular. Dalak, fare, ön orta hattına proksimal sol tarafında bir kesi karın duvarı düz iyi makas yapmak bir çift kullanarak erişmek için göğüs kafesi sadece ve posterior aksiler hattına vücut etrafında uzatmak. Dalak ucu görünür (şekil 3A) olmalıdır. Dalağını Dumont #7 forseps bir çift ile çekin ve yapışıklıklar serbest bırakmak için alt üzerinde kesti. Düz iyi makas çifti ~ 2 mm kalınlığında, kesitsel, dilim kesmek için kullanın. 5.1. adımda hazırlanan vakum yağ odasında dilimi yerleştirin. Birden çok dalak dilimleri tek bir odasında istenirse takılabilir. Sonunda odası ikinci coverslip vakum yağ RIM üstüne yerleştirerek ve yavaşça aşağı, tüm hava kabarcıkları A’ya kulak tuşuna basarak kapatın. Buz üstünde tüm görüntüleme chambers, görüntüleme ve photoactivation sırasında her zaman, hariç tutmak.Not: Bazı arabellek de itilmiş ama vakum yağ sıvı sızıntısını önleme sıkı bir mühür oluşturmalıdır. Dalak dilimler şimdi bir çift taraflı görüntüleme odasında (şekil 3B) olur. 6. Photoactivation Tanımlayıcı tek germinal merkezleriNot: Bu protokol için dalak açıklanan, ancak tamamen lenf düğümleri için benzerdir. Görüntüleme odası mikroskop sahnesinde yerini. 3,5 mL plastik transfer pipet kullanarak, bir damla distile su üst coverslip üstüne yerleştirin ve amacı iletişim noktası kadar düşük. İletilen ışık kullanarak doku üstüne odaklanmak. Karanlık modu ve iki fotonlu uyarma geçin ve lazer 940 için ayar nm.Not: uygun filtre setleri ile bu dalga boyu uyarma ve kolajen içeren yapıları büyük gemiler ve yapı elemanları ile ilgili yanı sıra adım 4.2, enjekte CD169 PE ikinci harmonik üretimi tespiti izin verir hangi marjinal Zon tanımlar. Ancak, 940 nm uyarma değil photoactivate PA-GFP yok. (CD169-PE boyama tarafından kapsanan) bireysel beyaz hamuru alanlarda doku yüzeye yakın yerelleştirilmesine ve merkezi arteriyol ile ilişkili ikinci harmonik üretimi tarafından periarteriolar lenfoid kılıf (PALS, T hücre bölge) tanımlar. Son derece autofluorescent, varlığı aktif tingible vücut makrofajlar (güçlü autofluorescent sinyal tüm kanalları, blob gibi bir görünüm karanlık çarpıtmalar ile) SARSAK ve marjinal Zon arasındaki bölgede bakın (şekil 4A).Not: gerekirse, doku istenmeyen yönünü nedeniyle, görüntüleme odası açtım ve görüntüleme diğer yönden gerçekleştirilebilir. 6.1.3. adımda tanımlanan işaretlerinden dayalı., bir bölge tek germinal merkez alan tanımlayan ilgi çekmek. Bir Z-yığını kurmak 100-150 µm derinlik, doku yüzeyinden başlayarak ve ~ 3 µm adım boyutunu kullanarak. 830 nm uyarma dalga geçin. Kapat veya duyarlilik dedektörleri için önlemek için tüm kanallar dim (gibi lazer güç ve çıkış Floresans genellikle bu dalga boyu önemli ölçüde daha yüksek) ve o zaman ‘resim yığını’.Not: Doku, kullanılan belirli doku ve görüntüleme sistemi derinlemesine lazer güç ve piksel Işınma Zamanı gibi belirli ayarları bağlıdır. Her uygulama kullanılan belirli görüntüleme sistemi için optimize var. O yığın boyunca verimli photoactivation almak için gerekli olmakla birlikte, duyarlilik değil hücreleri özen gösterilmelidir. Geri 940 nm uyarma dalga boyları için geçiş ve kanalları yeniden açın. (Şekil 4B) boyunca verimli photoactivation ve duyarlilik (diffüz, hücre sınırlı PA-GFP sinyal, siyah noktaları veya yüksek derece autofluorescence photoactivated alanında) yokluğu onaylamak için yığını üzerinden tarama. Photoactivate için tüm ilgili doku görüntüleme odasında devam, sonra hemen daha fazla işleme kadar buz geri döner. Ek görüntüleme odaları photoactivation ile devam edin.Not: Doku explanting, montaj ve özellikle photoactivation zaman alan işlemler olmakla birlikte, toplam teslimi etrafında zaman 4-6 saat hücre canlılığı dramatik bir düşüş önlemek için sınırlanması. 7. kurtarma ve photoactivated hücre analizi Lenf düğümleri ve dalak lenfositlerin çıkarma Her photoactivated örnek için BM arabelleği buz üzerinde 500 µL içeren bir buna göre etiketli 1.5 mL microcentrifuge tüpü hazırlayın. Bir PA GFP denetimi ve bir sigara aktif PA-GFP fare örnekleri içerir. Bu bir B6 denetim ve bir PA-GFP kontrol fare gibi tarafından gerçekleştirilebilir. Dikkatli bir şekilde üst kapak notu görüntüleme Odası (tek bir bölmede birden fazla örnekleri varsa) örnekleri konumunu korumak ve her örnek, ilgili örnek tüp içine yerleştirmek için dikkat çekici, kaldırın. Bir havaneli ile homogenizer kullanarak doku sıkmak ve havaneli lenfositler serbest bırakmak için tüpte twist. Bir micropipette kullanarak, lysate Aspire edin ve 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla bir taze, önceden soğutulmuş 1.5 mL microcentrifuge tüpüne filtre. Lenf nodu örnekleri için 7.1.5 adıma atlayın. Dalak örnekleri için santrifüj kapasitesi 200 x g sallanan bir kova Open End 4 ° C’de 5 min için de. Süpernatant atın ve Pelet RBC lizis arabellek 200 µL içinde resuspend. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya sonra buz gibi BM arabelleği 800 µL ekleyin ve 7.1.5 adıma devam edin. Vasıl 200 x g sallanan bir kova Open End 4 ° C’de 5 dakika santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve buz gibi BM arabellek 200 µL içinde resuspend. Örnekleri isterseniz akış sitometrik değerlendirme için boyama ve sıralama, için hazırsınız. Akış sitometrik değerlendirme için boyamaNot: panel önerdi: CD169-PE, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A647, CD38-PE-Cy7, düzeltilebilir canlılığı boya Efluor-780, GL7-Pasifik mavi. Sigara aktif PA-GFP Pasifik turuncu (veya eşdeğer) kanal algılanır. Photoactivated PA-GFP GFP kanalda algılanır. CD169-PE ile boyama ve bu dökümü kapısı olarak kullanarak (ki olabilir veya CD169-PE ile etiketli içinde vivo yapılmamış olabilir) herhangi bir ortak arıtılmış makrofajlar dışlanabilir. Bir micropipette kullanarak hücre süspansiyon her chimera ve denetim örnek için iyi başına 100 µL bir 96-şey tabak içinde ekleyin. B6 kontrol örnekleri için 50 µL günahı kontrol ve kumanda lekeli kuyu bu malzemenin ekleyin. Sigara aktif PA-GFP tek lekeli denetimi için Ayrıca 50 µL günahı olmayan aktif PA-GFP örneği ekleyin. Tek lekeli aktif PA-GFP kumandasında tüm photoactivated örnekleri için kalan malzeme havuz. Her şey, (günahı ve PA-GFP tazminat denetler) arabelleği 100 µL eklemek için tek antikor (tek lekeli tazminat denetimleri) veya antikor mix (photoactivated örnekleri). Buz üzerinde 20 dakikadır kuluçkaya. De 200 x g 4 ° C’de 5 dakika santrifüj kapasitesi Arabellek hafifçe vur. Her şey için BM arabelleği 200 µL ekleyin ve tekrar yıkamak için santrifüj kapasitesi. Arabellek fiske ve BM arabelleği 200 µL her kuyuya hücrelerde resuspend. Örnekleri analiz bir Akış Sitometresi veya sıralayıcı ( şekil 5temsilcisi sonuçları) için hazırsınız.