在自抗性混合奇美体模型中, 光激活询问个体自反应萌发中心

所有动物用途都符合欧洲共同体的准则, 并得到丹麦动物研究监察局的批准 (2017-15-0201-001348)。 1. 一般的老鼠饲养和缓冲器和工具的制备 在特定的无病原体 (SPF) 条件下, 对老鼠线进行定期监测, 并按照标准指南进行健康状况监测。 可选: 验证由于不受监测的不定部感染, 在天真的小鼠中没有自发的萌发中心。这可以通过免疫荧光显微镜 (胚细胞中心结构的存在) 或流式细胞仪 (萌发中心 b 细胞的频率) 来完成, 如前面所述的12。注: 可以使用女性或男性。一般来说, 它是理想的性匹配捐献者和接受者, 因为性别的不匹配理论上可以导致对男性 y 抗原的同种活动由女性收货者/捐献者15。 使用 CD45.1 收件人 (B6。SJL-PTPRCa pocc b/boyj), 年龄在6-10 左右。使用 564Igi (B6。Cg-ghtm1(Igh564)TikIgktm1(Igk564)Tik/j) 和 Pa-gfp (B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) 捐献者, 年龄在6-12。 消毒手术工具 (直精细剪刀和 Dumont 钳 #5 和 #7), 通过高压灭菌他们根据常规灭菌指南。 制备500毫升骨髓 (BM) 缓冲液, 其中含有磷酸盐缓冲盐水 (PBS)、2% 的胎儿牛血清 (FBS)、1 mM 乙二胺-四乙酸 (EDTA), ph 值7.4。要制备 BM 缓冲液, 请添加10毫升的热失活 (在56°c 的水浴中1小时以灭活补体) FBS 和 4400 mM EDTA 溶液的 1.25 mL (调整为 ph 7.4) 至500毫升的 PBS、pH 7.4, 并混合良好。使用0.2μm 滤瓶过滤缓冲液。 用试剂级水稀释10倍库存的1毫升至总体积10毫升, 制备10毫升红细胞 (RBC) 裂解缓冲液 (155 Mm Nh4 cl, 12 mM nahco3, 0.1 mm edta)。用 5 mM EDTA, ph 7.4, 准备50毫升的 PBS。 2. 骨髓混合嵌合体的建立 接受者的辐射 (第0天) 将 CD45.1 骨髓接受者放置在适当的辐照容器中, 并在伽玛辐射器中照射 1, 100 拉。注: 可使用替代辐照源。无论来源如何, 剂量/时间都必须优化, 以产生最大的清髓性效果, 同时最大限度地减少对动物的附带组织损伤。 放置在抗生素水上 (1 毫克磺胺嗪和0.2 毫克三甲吡啶饮用水)。 骨骼的提取 (第1天) 通过4% 异氟醚在空气中的连续流动, 对564Igi 骨髓供体进行麻醉, 并通过宫颈脱位对其进行安乐死。用乙醇喷洒捐献者, 并将其放置在流动罩中的无菌手术垫上。继续使用无菌缓冲液和设备来维护无菌条件。 要提取股骨和胫骨, 首先在脚踝周围做一个切口, 并使用直的精细剪刀向上延伸到臀部。使用重型钳子或拇指和食指, 将皮肤向上和从腿向身体拉去。同样, 把皮肤拉下来和脚部。 通过抓住臀部的腿和用力拉脚, 弹出膝盖和脚踝关节。继续打破踝关节, 并将脚向身体, 同时抓住胫骨, 从而剥离胫骨的肌腱和肌肉。 打破膝关节, 释放胫骨, 并同样拉这对身体, 同时坚持股骨, 从而剥离肌腱和肌肉的股骨。在髋关节上做一个切口, 并切断肌腱, 然后将股骨从髋关节插槽中拉出。重复2.2.2 步骤–对侧2.2.4。 用粗纸巾擦拭骨头, 仔细清洁骨骼, 以去除所有剩余的肌肉和结缔组织。然后用冰凉的 BM 缓冲液冲洗它们, 最后用一对 Dumont #7 钳子将它们转移到冰上新鲜的冷 BM 缓冲液中。对 PA-GFP 捐助者重复步骤2.2。注: 单个供体的骨髓细胞数量因性别和年龄而异。根据所需的骨髓比率和数量以及所需的受者数量, 对捐献者的数量进行缩放。如果捐献者很少, 前肢可以包括在骨髓提取。这通常会产生从后肢获得的额外的1.5 至一半的细胞。通常情况下, 每个捐献者可在5000万细胞之间恢复5000万细胞, 具体取决于年龄、性别、背景以及是否只包括后肢或后肢和前肢。 骨髓细胞提取 在冰凉的 BM 缓冲液中冲洗, 准备砂浆。排出漂洗缓冲液, 并使用带有10毫升血清学移液器的电动移液器控制器, 添加10毫升新鲜的冰凉 BM 缓冲器。 用一对 Dumont #7 钳子将骨头从564Igi 捐献者转移到砂浆中, 用子压碎和磨碎骨头以释放骨髓。用10毫升血清学移液器将骨髓提取物吸吸, 并将其通过70μm 的细胞过滤器进入冰上的50毫升管中。 在砂浆中添加另外10毫升的新鲜冰凉 BM 缓冲液, 并重复, 以确保细胞完全恢复。用纸巾从砂浆中取出骨材料, 适当丢弃, 用70% 乙醇仔细冲洗砂浆, 然后用 BM 缓冲液冲洗砂浆。对 PA-GFP 骨髓供体组重复步骤2.3。 骨髓细胞计数 使用微移液器, 将含有40μl 红细胞裂解缓冲液的液滴放在一块塑料石蜡膜上。将564Igi 骨髓管反转几次, 并使用微型移液器取出10Μl 的 aliquot。将其与40μl 的红细胞裂解缓冲液滴混合。 随后加入50Μl 的 Trypan 蓝色 (0.4% 在水溶液中) 的下降。立即将产生的混合物装入伯克蒂尔克血细胞仪, 并在显微镜下计数。使用10倍的总稀释系数计算每个 mL 的细胞数。确认足够的细胞活力 & gt;90%。对 PA-GFP 骨髓供体组重复步骤2.4。 准备暂停捐献者 根据第2.4 步获得的数量和所需的受者人数, 计算两个供体群体中每个供体骨髓的数量, 并将其混合在供体混合管中。注: 例如, 对于建立一组1:2 混合 564Igi:PA-gfp 烟囱与 6个 CD45.1 收件人: 每个接收者总共需要 20 x 106个供体细胞, 1个部分564igi 和2个部分 PA-GFP。因此, 这需要 6 x 半 x 20 x10 6 = 40 x 10 6 564igi供体细胞和 6 x 2/x20 x 10 6 = 80 x 10 6 pa-gfp 供体细胞. 将适当数量的 PA-GFP 和564lgi 供体骨髓混合在一个50毫升的锥形管中。用摆动的桶式转子在 200 x g和4°C 下离心骨髓混合物10分钟。 在每毫升密度为 1 x 10 8个细胞的情况下, 对上清液进行分解, 并在冰冷的 bm 缓冲液中重新悬浮细胞。在冰上转移到预冷 1.5 mL 微离心管。 用供体骨髓重组骨髓受者 在空气中连续流动4% 异氟烷的诱导下, 接受者进行麻醉, 维护率为3.75。通过不使用脚趾夹紧反射来验证足够的麻醉平面。 小心地轻触含有骨髓混合物的试管, 以确保骨髓细胞充分重新悬浮, 然后在0.3 毫升, 30 规格的胰岛素注射器中吸入200Μl 的骨髓混合物 (~ 20 x10 6细胞)。 将受者放在其一侧, 轻轻拉伸眼睛上方和下方的皮肤, 稍微 “弹出眼睛”, 然后以大约30°的角度将注射器的尖端轻轻插入眼窝的前面, 注意避开眼睛和周围的组织。当针头被感觉触摸眼窝下划线的骨头时, 稍微收回 (~ 0.5 毫米), 用稳定的压力慢慢注射供体骨髓。注: 注射时不应出血, 无液体泄漏, 眼睛也不会轻微鼓胀。 用利比特糖抗生素水将鼠标送回笼子, 并验证手术后立即恢复。对每个收件人重复步骤2.6。注: 尾静脉注射可以用来代替类似的结果, 但在我们手中, 它的速度要慢得多, 这可能是一个问题, 当与大量的接受者合作。应避免直接在小直径床上用品上回收麻醉动物, 因为这会带来吸入和窒息的风险 去除抗生素水 (第14天) 从笼子里取出抗生素水, 用新鲜的普通饮用水代替。 3. 检查成功的重组并核实适当程度的嵌合体 (第6周) 烟囱后眼眶出血及对照 根据受者的耳标编号, 通过标记 1.5 mL 微型离心管, 并添加含有 5 mM EDTA 的 50ΜL PBS, 准备采血管。注: 包括对 PA-GFP、CD45.1 和 CD45.2 以及 9D11 (特定类型) 的适当控制。这可以通过包括 1个 PA-GFP + 鼠标、1个 CD45.1 鼠标、1个 B6 鼠标和 1 564Igi 鼠标来实现。 麻醉小鼠, 并验证足够的麻醉平面作为步骤2.6.1。将嵌合体放在它的一侧, 轻轻伸展眼睛上方和下方的皮肤, 稍微 “弹出眼睛”。 轻轻地将一个 bopet 包裹的肝化毛细管 (60μl 内量) 大约以40°的角度插入眼窝的前部, 注意避免损坏眼睛和周围组织。轻轻旋转管, 直到它开始充满血液。 允许血液通过毛细管作用被动地充满管, 直到几乎完全满, 然后收回管并将其放入相应的预标记收集管, 同时立即放松眼睛周围的抓地力, 让眼睛安顿好, 回到原处。出血应立即停止。 确保毛细管已倒入收集管, 并将其丢弃在锐器容器中。关闭管并反转三次, 以确保与 pbsedta 完全混合。 将鼠标返回到保持架, 并验证从过程中立即恢复。对每个实验鼠标和相应的控件重复步骤3.1。注: 使用下颌静脉穿刺时要小心, 因为这种方法可能会对辐照受者造成更大的风险, 然后再进行完全重组。此外, 根据我们的经验, 我们发现, 收集的血液量和因过度出血而损失的血液量变化较大。这两个考虑因素都很重要, 因为骨髓嵌合体在重建阶段是敏感的, 在新骨髓被完全嫁接和造血恢复正常水平之前。 外周血单个核细胞 (PBMC) 纯化 血液采集完成后, 以低速 (lt;200 x 克) 短暂离心管, 收集管内底部稀释的稳定血液。 用淋巴细胞分离培养基填充10毫升注射器, 并加入 18 G 针。将针头插入第一管底部, 并在血液样本中加入1毫升淋巴细胞分离介质。小心地取出针头, 用纸巾擦拭, 以防止下一个样品交叉污染。 在 800 x 克的室温下, 在一个秋千桶离心机中, 在所有样品中进行25分钟的离心, 刹车设置为低。 准备一套相应标记的 1.5 mL 微离心管, 每个管含有1毫升的冰凉 BM 缓冲液。 离心后, 对于每个样品, 进入上 (等离子体) 层与200Μl 微移液器和吸气的单核细胞 (MNC) 层正上方的接口。将细胞转移到含有1毫升 Bm 缓冲液的相应标记管。合上盖子, 倒置混合。丢弃含血淋巴细胞分离中的导管。 继续通过所有样品, 然后离心在 200 x g 5分钟, 4°c 在一个摆动的桶转子。吸吸和丢弃上清液, 并在200μl 的冰凉 BM 缓冲液中重新悬浮颗粒。样品现在已经准备好进行抗体染色和流式细胞仪分析。 用于流式细胞仪评估的染色注: 建议的面板: CD45.1-FITC, B220-Percp5.5, 9D11-a568, CD45.2-APC。在太平洋橙色 (或等效) 通道中检测到非激活的 PA-GFP。由于淋巴细胞分离去除了死亡细胞, 因此不需要使用活度染料。 使用微移液器, 在96孔板中添加100Μl 的细胞悬浮液, 每个井的嵌合体和对照样品。 对于3个非 Pa-gfp 控制样品, 将每个样品剩余的 100μl (总计 300Μl) 集中起来。加入50μl 的这种材料, 用于无染色控制和单染色控制井。对于 PA-GFP 单染色控制, 另外还可添加50Μl 的未染色 PA-GFP 样品。 在每口井中, 加入100μl 的缓冲液 (未染色)、单片抗体 (单染色补偿控制, PA-GFP 补偿控制除外) 或抗体混合 (样品)。在冰上孵化20分钟。 在4°c 下以 200 x g 离心5分钟。将缓冲区翻转出。在每口井中加入200Μl 的 BM 缓冲液, 再进行离心机清洗。在200μl 的 BM 缓冲液中, 将缓冲液弹出来, 并在每口井中重新悬浮细胞。这些样品现在已经准备好在流式细胞仪上进行分析 (图 1)。注: 从6周开始, 可在任何时间点分析嵌合体中的萌发中心响应。 4. 在体内标记边缘区/囊下窦, 以帮助识别单个萌发中心 注: 目前的协议被证明为足部淋巴结 (腹股沟淋巴结) 和静脉注射 (即脾脏), 但可以根据目标部位变化。 双侧脚垫注射治疗下肢淋巴结贴标 2.6.1 的步调一致地对老鼠进行麻醉。 在 1.5 mL 微离心管中, 在18μl 的 pbs 中稀释 pe-l 标记大鼠 CD169 抗体, pH 7.4。将两滴10Μl 的混合物放在一块塑料石蜡膜上。用0.3 毫升的胰岛素注射器和30规格的针头对每个液滴进行吸气。 在脚垫 (在脚垫中央部以5-10°角与针头进入, 从脚趾开始的近端进入, 并将针头大约向脚后跟插入一半) 或 hock (用针头进入 5-10°角刚好在脚后跟上方, 沿跟腱轴线向膝盖方向插入约一半的长度)。把老鼠送回笼子里, 等大约 15分钟, 然后继续执行第5步。 静脉注射治疗脾脏贴药 2.6.1 的点对老鼠进行麻醉。 在 1.5 mL 微离心管中, 在90μl 的 pbs 中稀释 PE-TAT 标记大鼠抗小鼠 CD169 抗体10μl。用0.3 毫升胰岛素注射器吸入混合物。 按照步骤2.6 进行反轨道注射。把老鼠送回笼子里, 等大约 15分钟, 然后继续执行第5步。注: 作为异氟醚的替代品, 可使用注射麻醉剂, 如凯塔明-西拉嗪混合物;但是, 这通常会导致恢复时间变慢。由于淋巴引流通常受到骨骼肌运动的影响, 预计这将导致缓慢的引流时间。 5. 切除脾脏和淋巴结, 准备光激活 准备双面成像和光激活室 从20毫升注射器中取出柱塞, 然后用真空润滑脂将真空润滑脂管的喷嘴插入其中, 将柱塞回载。然后从5毫升注射器中取出柱塞, 然后使用20毫升注射器使用真空润滑脂对其进行回装。 使用加载的5毫升注射器的真空润滑脂, 通过在平面上放置方形盖板, 并使用真空润滑脂 (从边缘约1-2 毫米) 沿着盖板的边缘进行跟踪, 来准备成像和光激活室。注: 请注意避免真空润滑脂污染任何和所有表面, 随后接触到显微镜镜头, 因为在浸入水中乳化的真空润滑脂的微滴可能会污染镜头。 用冷 BM 缓冲液填充盖滑移真空润滑脂室, 放在冷平面上。 收集淋巴结和脾脏 对体内标记的嵌合体小鼠进行安乐死标记, 并按每步2.2.1 进行分析。用70% 的乙醇把尸体喷下来。 要进入下肢淋巴结, 使用直的精细剪刀在膝盖坑下面的皮肤上做一个切口, 并沿腿筋线向上延伸, 直到髋关节。使用 Dumont #5 或 #7 钳子, 将皮肤的每个暴露的皮瓣向外拉, 以暴露腹股沟窝中的组织 (图 2a)。 使用一对 Dumont #5 钳, 小心地进入下肢窝只是内侧到下肢静脉, 并解剖开放脂肪, 通过插入和打开和关闭钳子沿腿部轴线, 以暴露潜在的下肢淋巴结。 用拇指和食指将股四头肌从前侧捏到膝盖, 将淋巴结从窝里弹出 (图 2b)。用钳子从下面取下淋巴结, 将其从周围组织中分离出来 (图 2c), 然后将其放置在步骤5.1 中准备的真空润滑脂室中。 重复5.2.2 步骤–对侧5.2.4。如果需要, 可以在单个房间内安装多个淋巴结。 最后关闭室, 将第二个盖板放在真空润滑脂边缘的顶部, 轻轻按下, 注意挤出所有气泡。注: 某些缓冲器也可能被推出, 但真空润滑脂应形成紧密密封, 防止液体泄漏 (图 2d)。淋巴结现在处于双面成像室。 要进入脾脏, 使用一对直的细剪刀, 通过小鼠左侧的腹壁, 近端的前内侧线, 就在胸腔下方, 并将其延伸到身体周围的后腋窝线。脾脏的尖端应该是可见的 (图 3 a)。 用一双 Dumont #7 钳子拔掉脾脏, 并将下面的粘连剪断以释放。使用对直的精细剪刀切割 ~ 2 毫米厚, 横截面, 切片。 将切片放入步骤5.1 中准备的真空润滑脂室。如果需要, 可以在一个房间内安装多个脾脏片。 最后关闭室, 将第二个盖板放在真空润滑脂边缘的顶部, 轻轻按下, 注意挤出所有气泡。除成像和照片激活期间外, 始终将所有成像室放在冰上。注: 某些缓冲器也可能被挤出, 但真空润滑脂应形成紧密密封, 防止液体泄漏。脾脏片现在在一个双面成像室 (图 3b)。 6. 光激活 确定单一的萌发中心注: 此协议描述的脾脏, 但完全类似的淋巴结。 将成像室放置在显微镜舞台上。使用 3.5 mL 塑料转移移液器, 在上盖板上放置一滴蒸馏水, 并将目标降低到接触点。使用透射光聚焦在组织的顶部。 切换到暗模式和双光子激发, 并将激光调整到 940 nm。注: 使用适当的滤波器组, 此波长允许在与主要容器和结构元素相关的含有胶原蛋白的结构中激发和检测第二次谐波的产生, 以及在步骤4.2 中注入的 CD169-PE,确定边缘区域。然而, 940 纳米的激发并不光激活 PA-GFP。 在组织表面附近本地化单个白髓区域 (受 CD169-PE 染色的限制), 并通过与中央动脉相关的第二次谐波生成来识别动脉周围的淋巴鞘 (PALM, T 细胞区)。在 PALM 和边缘区域之间的区域中, 寻找高度自体荧光、活化的光体巨噬细胞 (所有通道中的强自体荧光信号、带有暗液泡的类似斑点的外观) (图 4 a)。注: 如有必要, 由于组织的不良方向, 可翻转成像室, 并可从另一个方向进行成像。 根据6.1.3 步骤中确定的特征, 绘制一个感兴趣的区域, 确定一个单一的萌发中心区域。设置约100-150μm 深度的 z 堆栈, 从组织表面开始, 并使用约3μm 的步长。 切换到 830 nm 激发波长。关闭或调暗所有通道, 以防止光污染探测器 (因为激光功率和输出荧光通常要高得多, 在这个波长), 然后 “图像” 堆栈。注: 特定设置, 如激光功率和像素停留时间, 取决于组织的深度、使用的特定组织和成像系统。每个应用程序都必须针对所使用的特定成像系统进行优化。虽然在整个堆栈中获得有效的光激活是必不可少的, 但应该注意不要对细胞进行光适应。 切换回 940 nm 激发波长并重新打开通道。通过堆栈扫描以确认整个过程中的有效光激活 (图 4b) 和光采样的缺失 (漫反射、无细胞界的 pa-gfp 信号、暗斑或光激活区域的高度自荧光)。 继续拍摄成像室中的所有相关组织, 然后及时将其返回冰层, 直至进一步处理。继续对额外的成像室进行光激活。注: 组织引导、安装, 尤其是光激活是耗时的过程, 但总周转时间应限制在 4-6, 以防止细胞活力大幅下降。 7. 光活化细胞的回收和分析 从淋巴结和脾脏中提取淋巴细胞 对于每个光活化样品, 准备一个相应标记的 1.5 mL 微离心管, 其中含有500μl 的 BM 冰上缓冲液。包括来自非 Pa-gfp 控件和非激活的 PA-GFP 鼠标的样本。这可以通过包括一个 B6 控件和一个 PA-GFP 控制鼠标来实现。 小心地从成像室取出上盖滑块, 注意保持样品的位置 (如果单个样品存在于一个样品中), 并将每个样品放入各自的样品管中。 使用牙分质器, 挤压组织和扭曲在管内的牙舌释放淋巴细胞。使用微移液器, 吸气液, 并通过70μm 的电池过滤器过滤成一个新鲜的, 预冷 1.5 mL 微离心管。对于淋巴结样本, 请跳到步骤7.1.5。 对于脾脏样品, 在摇摆不定的桶转子中, 在 200 x g 下离心 5分钟, 在4°c 下。丢弃上清液, 在200μl 的红细胞裂解缓冲液中重新悬浮颗粒。在室温下培养 5分钟, 然后加入800Μl 的冷 BM 缓冲液, 然后继续7.1.5。 在摇摆不定的桶式转子中, 以 200 x g 离心, 在4°c 下进行5分钟的离心。丢弃上清液, 在200μl 的冰凉 BM 缓冲液中重新悬浮。如果需要, 样品现在可以染色, 以便进行流式细胞仪评估和分类。 用于流式细胞仪评估的染色注: 建议的面板: CD169-PE, B220-Percp5.5, 9D11-a647, CD38-PE-CY7, 可固定活力染料 e氟-780, GL7-太平洋蓝。在太平洋橙色 (或等效) 通道中检测到非激活的 PA-GFP。在 GFP 通道中检测到光激活的 PA-GFP。任何共同纯化的巨噬细胞 (可能在体内也可能没有用 CD169-PE 标记) 可以通过用 CD169-PE 染色并将其用作转储门来排除。 使用微移液器, 在96孔板中为每个孔和对照样品添加100Μl 的细胞悬浮液。 对于 B6 控制样品, 添加50Μl 的这种材料, 用于未染色控制和单染色控制井。对于未激活的 PA-GFP 单染色控制, 另外添加50Μl 的未染色无源 PA-GFP 样品。对于激活的 PA-GFP 单染色控制, 将所有光激活样品的剩余材料集中起来。 在每口井中, 添加100Μl 的缓冲液 (未染色和 PA-GFP 补偿控制)、单抗体 (单染色补偿控制) 或抗体混合 (光激活样品)。在冰上孵化20分钟。 在4°C 下以 200 x g 5分钟离心。将缓冲区翻转出。在每口井中加入200Μl 的 BM 缓冲液, 再进行离心机清洗。在200μl 的 BM 缓冲液中, 将缓冲液弹出来, 并在每口井中重新悬浮细胞。这些样品现在已经可以在流式细胞仪或分选仪上进行分析 (图 5中具有代表性的结果)。