В Vitro Увселицивание и Deubiquitination Анализы Нуклеосомальных Хистонов

Увселивание является одним из наиболее сохранимых пост-трансляционных модификаций и имеет решающее значение для широкого круга организмов, включая дрожжи, растения и позвоночных. Убиквитинация состоит из ковалентной привязанности убиквитина, высоко консервированных 76 аминокислот ный полипептид, для целевой белков и происходит в трех последовательных шагов с участием трех ферментов, т.е., E1-активизирующих, E2-конъюгии и E3 лигазы^{1, 2,3}. Эта посттрансляционная модификация играет центральную роль в широком спектре биологических процессов. Действительно, Лигазы E3, которые обеспечивают специфику реакции, представляют собой большое суперсемейство ферментов и являются наиболее распространенными ферментами системы убиквитин^4,5,6. Эффекты убиквитина белка в нистечении зависят от характера модификации: монобиквицинация, мультимонобиквитивание, линейная или разветвленная поликубиквициаляция. Монобиквитинация редко ассоциируется с протеасомальной деградацией, но вместо этого эта модификация участвует в посредничестве различных сигнальных событий. Полиубиквитинация включает в себя N-терминал или остатки лизин в самой молекуле убиквитин, и судьба полиубиквитинаированного белка зависит от того, какие остатки участвуют в расширении цепи убиквитин. Давно известно, что полиубиквитинация при посредничестве лизин 48 убиквитин вызывает протеасомальную деградацию. Напротив, полиубиквитинация через лизин 63 убиквитин часто ассоциируется с активацией белка^7,8,9. Как и другие важные пост-трансляционные модификации, убиквитинация обратима, а удаление убиквитина из белков обеспечивается специфическими протеазами, называемыми deubiquitinases (DUBs), которые стали важными регуляторами клеточных процессов ^{2 , 10}. Важно, что многие ДУБ являются узкоспециализированными, и регулировать, через deubiquitination, конкретные субстраты, указывая, что тонкий баланс между убиквитинации и деубиквитинации имеет решающее значение для функции белка. E3s и DUBs, наряду с протеаомой деградации машин и вспомогательных факторов, образуют Убиквитин Proteasome системы (UPS, с генами, с йgt;1200 генов), который регулирует основные пути сигнализации, некоторые из которых связаны с ростом клеток и пролиферации, Определение судьбы клетки, дифференциация, миграция клетки, и смерть клетки. Важно отметить, что дерегулирование нескольких сигнальных каскадов, связанных с убиквитинированием способствует опухолевому и нейродегенерационезу^{5,11,12,13, 14}.

Убиквитинация играет всепроникающую роль в биологии хроматина и ДНК-зависимых процессах^15,16,17. Например, монобиквицинирование гистона H2A на лизин 119 (далее H2A K119ub) является критической посттрансляционной модификацией, участвующей в транскрипционных репрессиях и репарации ДНК^{18,19,20, 21,22}. H2A K119ub является катализатором Поликомб Репрессивный комплекс 1 (КНР1), который играет ключевую роль в поддержании эпигенетической информации и высоко сохраняется от drosophila к человеку. Канонические КНР1 состоит в частности, ПО RING1B и BMI1, которые являются ядром E3 убиквитин лигаза комплекса, ответственного за вышеупомянутое событие вездесущности^22,23. В Drosophila, H2A монобиквицинация (H2A K118ub, который соответствует H2A K119ub у млекопитающих) меняется DUB Calypso, который взаимодействует с дополнительной секс гребень (ASX) формирования Поликомб-репрессивных DUB (PR-DUB) комплекс²⁴. Орфога цимбаты калипсо, BAP1, является супрессор опухоли удалены или инактивированы в различных злокачественных новообразований человека^{25,26,27,28, 29 , 30 год , 31} год ^{, 32 год , 33}. BAP1 регулирует ДНК-зависимые процессы в ядре и кальций-сигналоцитов опосредованного апоптоза в эндоплазмической ретикулум^{33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 г. , 41 год , 42}. BAP1 собирает многодефицитные белковые комплексы, содержащие регуляторы транскрипции, в частности ASXL1, ASXL2 и ASXL3 (ASXLs), три ортологи ASX^38,43. ASXLs использовать DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) домен, также называется ДОмен ASXM, чтобы стимулировать BAP1 DUB деятельности^35,36,44. Таким образом, ASXLs играют важную роль в координации активности BAP1 DUB при хроматине и в более широком смысле его функции супрессора опухоли.

Существует несколько методов изучения процессов повсеместного и деубиктивизации. Примечательно, что биохимические анализы с использованием белков, очищенных от бактерий, остаются очень мощными в демонстрации прямого убиквитина или удаления убиквитина из конкретных субстратов. Эти эксперименты могут быть проведены для изучения ряда параметров, таких как определение требования минимальных комплексов, определение кинетических реакций, определение структуры / функциональных отношений, а также понимание влияния патологических генных мутаций. Здесь мы предоставляем протоколы для проведения убиквитинации и дезюквитинационных реакций на хроматина субстратах с очищенными компонентами. В качестве модели системы представлена увселивания в пробирке и деубиктивирование нуклеосомального белка H2A. Бактерии очищенные белки, собранные в минимальных комплексах RING1B/BMI1 и BAP1/DEUBAD, используются для убликвитина или деубиктинации нуклеозомального H2A, соответственно.