JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
유전학

Isolatie van papillaire en reticulaire fibroblasten van menselijke huid door fluorescentie-geactiveerde cel het sorteren

Published: May 07, 2019
doi:
10.3791/59372
, ,
1Skin, Endothelium Research Division, Department of Dermatology,Medical University of Vienna

Summary

Dit manuscript beschrijft een FACS-gebaseerd protocol voor isolatie van papillaire en reticulaire fibroblasten van menselijke huid. Het omzeilt in vitro cultuur die onvermijdelijk was met de algemeen gebruikte isolatie protocol via explant culturen. De afkomstige fibroblast subsets zijn functioneel onderscheiden en display differentieel genexpressie en lokalisatie binnen de dermis.

Abstract

Fibroblasten zijn een zeer heterogene cel populatie betrokken bij de pathogenese van veel menselijke ziekten. In de menselijke huid dermis, fibroblasten zijn van oudsher toegeschreven aan de oppervlakkige papillaire of lager reticulaire dermis volgens hun histologische lokalisatie. In de muis dermis, papillaire en reticulaire fibroblasten afkomstig uit twee verschillende geslachten met uiteenlopende functies met betrekking tot fysiologische en pathologische processen en een aparte cel oppervlakte marker expressie profiel waarmee ze kunnen worden onderscheiden.

Belangrijk is dat het bewijs van explant culturen uit oppervlakkige en lagere dermale lagen suggereren dat ten minste twee functioneel onderscheiden dermale fibroblasten lineages bestaan in de menselijke huid dermis ook. Echter, in tegenstelling tot voor de muis huid, cel oppervlak markers waardoor de discriminatie van verschillende fibroblast subsets nog niet zijn vastgesteld voor de menselijke huid. We ontwikkelden een nieuw protocol voor de isolatie van menselijke papillaire en reticulaire fibroblast populaties via fluorescentie-Activated Cell Sorting (FACS) met behulp van de twee cel oppervlakte markers fibroblast activatie proteïne (FAP) en Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. Deze methode maakt het isoleren van zuivere fibroblast subsets mogelijk zonder in vitro manipulatie, die werd aangetoond dat de genexpressie beïnvloeden, waardoor nauwkeurige functionele analyse van de menselijke dermale fibroblast subsets met betrekking tot weefsel homeostase of ziekte Pathologie.

Introduction

Als belangrijkste cellulaire component van bindweefsel, zijn fibroblasten hoofdzakelijk verantwoordelijk voor de afzetting van collageen en elastische vezels die uiteindelijk de extracellulaire matrijs1vormen, en zo, hun rol in weefsel homeostase, regeneratie en ziekte is onderschat voor een lange tijd. Echter, fibroblasten zijn onlangs onder de schijnwerpers van onderzoekers, niet alleen omdat ze vertegenwoordigen een prominente cellulaire bron voor geïnduceerde pluripotente stamcellen2 , maar ook vanwege hun hoge plasticiteit en implicatie in de pathogenese van een groot aantal ziekten zoals orgaan fibrose3,4,5 of kanker6,7.

Menselijke huid is samengesteld uit een multi-layered epitheel, de epidermis, en de onderliggende bindweefsel, de dermis, die kan worden histologisch onderverdeeld in de bovenste papillaire en de onderste reticulaire dermis en is voornamelijk samengesteld uit fibroblasten en extracellulaire matrijs8 en dermis. Volgens hun plaats binnen het weefsel, zijn de dermale fibroblasten ruwweg geclassificeerd in papillaire en reticulaire fibroblasten1.

Belangrijk, recente gegevens blijkt dat deze dermale fibroblast sub-populaties zijn niet alleen histologisch te onderscheiden, maar ook dat hun functie is aanzienlijk divers. In de huid van de muis, papillaire en reticulaire fibroblasten ontstaan uit twee verschillende geslachten tijdens embryogenese9. Verschillende lijnen van het bewijs suggereert dat de twee geslachten verschillende rollen uitoefenen, niet alleen in weefsel homeostase, haarfollikel morfogenese, wond reparatie en fibrose7,9,10, maar ze ook reageren op verschillende signalen van neoplastische epidermale stamcellen11, wat suggereert uiteenlopende rollen in de pathogenese van kanker. Gunstig, beide lineages Express een duidelijke set van wederzijds exclusieve cellulaire markers in volwassen muis huid, waardoor de isolatie van zuivere dermale fibroblast populaties en de daaropvolgende uitgebreide analyse van hun specifieke functies in vitro9 , 11.

Dienovereenkomstig, ten minste twee verschillende fibroblast subsets met verschillende morfologie en functies, met inbegrip van uiteenlopende proliferatie percentages, weefsel remodeling capaciteiten12,13, evenals de mogelijkheid om de groei van de ondersteuning van epidermale stamcellen in vitro, zijn beschreven voor de menselijke huid dermis14,15. Echter, de meeste van de gepubliceerde studies over menselijke dermale fibroblasten zijn uitgevoerd met behulp van gemengde fibroblast populaties geïsoleerd van explant culturen uit dermatomed huid, omdat specifieke cel oppervlakte marker sets waardoor de isolatie van zuivere menselijke papillaire of reticulaire fibroblast sub-bevolkingen in analogie met de muis dermis moesten nog worden vastgesteld.

We hebben onlangs aangetoond, dat de menselijke huid papillaire en reticulaire fibroblasten worden gekenmerkt door specifieke cel oppervlakte markers die de isolatie van de respectieve sub-populaties mogelijk te maken via fluorescentie-geactiveerde cel sorteren (FACS)16: FAP + CD90– fibroblasten vertegenwoordigen papillaire fibroblasten voornamelijk gelegen in de bovenste dermis, presenteren hogere proliferatie percentages, een duidelijke gen handtekening, maar geen adipogenic potentieel. FAP+CD90+ en FAP–CD90+ fibroblasten behoren tot de reticulaire afstamming van de lagere dermale compartimenten, die minder proliferatie, maar gemakkelijk ondergaan adipogenesis-een kenmerk voor reticulaire fibroblasten. Deze methode maakt het mogelijk om deze verschillende fibroblast subpopulaties uitvoerig te bestuderen, niet alleen in verband met hun specifieke functies onder fysiologische omstandigheden, maar ook in de context van de pathogenese van cutane ziekten, waaronder huidkanker.

Echter, aangezien fibroblasten veranderen hun cel oppervlakte marker expressie in twee-dimensionale in vitro cultuur16,17,19, de toepassing van ons protocol is beperkt tot de isolatie van primaire fibroblasten van de menselijke dermis en staat niet de identificatie van papillaire of reticulaire fibroblasten in de gemengde bevolking van de cultuur van de cel toe. Belangrijk, hoewel de uitdrukking van cel oppervlakte markers veranderingen in vitro, hebben we aangetoond dat de Fibroblast subsets geïsoleerd volgens het protocol hieronder beschreven behouden hun specifieke functionaliteit bij gekweekte16, waardoor in vitro studies van subset-specifieke eigenschappen onder fysiologische of pathologische omstandigheden.

Tot slot hebben we een protocol ontwikkeld voor het isoleren van verschillende fibroblast subsets via FACS die voor het eerst het isoleren van zuivere fibroblast populaties van de menselijke huid dermis in een naïeve staat toelaat.

Protocol

De menselijke huid werd verkregen van Kaukasische mannen en vrouwen van 26 tot 61 jaar (zon-beschermde huid; buik correcties, borst verminderingen). Schriftelijke geïnformeerde toestemming van de patiënt is verkregen vóór weefsel inzameling in overeenstemming met de verklaring van Helsinki, en met goedkeuring van de Vienna Medical University Institutional Review Board. Opmerking: Wij verstrekken een protocol voor de isolatie van functioneel DISTINCT fibroblast sub-bevolkingen of van volledige dikte dermis (gelieve te verwijzen naar sectie 1) of na het secties van menselijke huid dermis in zijn verschillende lagen (Skip sectie 1 en verwijzen direct naar sectie 2) . 1. voorbereiding van de volledige dikte dermis Plaats een 10 cm x 10 cm menselijk huid stuk (bijv. van abdominale correcties of borst verminderingen) met de epidermis naar beneden gericht op dik filtreerpapier. Houd de epidermis strak op de randen met een tang en schraap de onderhuidse vette laag met een scalpel. Dan snijd het weefsel in 5 mm brede stroken alvorens hen in een Petri schaal te zetten.Opmerking: Dit vergemakkelijkt penetratie van Dispase II (die als het scheiden enzym voortaan wordt bedoeld, zie sectie 3) en wordt gebruikt als de epidermis van de volledige dermis moet worden gescheiden. Voor deze Skip sectie 2 en direct verwijzen naar paragraaf 3. Om verontreiniging te vermijden, houd het weefsel steriel na chirurgische verwijdering of maak het grondig met ethylalcohol of jodiumoplossing schoon. Als op alle, ethanol behandeling van het huidoppervlak veroorzaakt slechts geringe celdood. Werk onder steriele omstandigheden in een weefselkweek debiet kap. 2. sectieing van de menselijke huid dermis in papillaire en reticulaire lagen met een dermatoom Plaats een 10 cm x 10 cm huid stuk (bijv. van abdominale correcties of borst verminderingen) op dik filtreerpapier, met de epidermis naar boven gericht. Houd de huid strak op de randen met een tang. Snijd de huid met een elektrisch dermatoom, aangepast aan een snijdikte/diepte van 300 µm, door het hoofd van de dermatoom uit de buurt van zichzelf te schuiven, waarbij het mes zich op een hoek van 90 ° bevindt ten opzichte van het oppervlak van de huid. Neem de eerste laag bestaande uit epidermis en papillaire dermis (300 µm dik, “dermale laag 1”, Figuur 1 en Figuur 2) en zet het in een Petri schaaltje. Ga onmiddellijk naar sectie 3 of Voeg 1x PBS toe om het weefsel te houden van het uitdrogen.Opmerking: Om verontreiniging te vermijden, houd weefsel steriel na chirurgische verwijdering of maak het grondig met ethylalcohol of jodiumoplossing schoon. Werk onder steriele omstandigheden in een weefselkweek debiet kap.Let op: Handvat dermatoom voorzichtig, omdat de messen zijn zeer scherp. Herhaal stap 2,2 het aanpassen van de dermatoom op een snijdikte van 700 µm en snijd de resterende dermis. Plaats de bovenste schijf die is gedefinieerd als de bovenste reticulaire dermis (“dermale laag 2”, Figuur 2) in een aparte Petri schaaltje. Ga onmiddellijk naar sectie 4 of Voeg 1x PBS toe om het weefsel te houden van het uitdrogen. Schraap de onderhuidse vette laag met een scalpel van de resterende lagere reticulaire dermale laag (> 1000 µm) en gooi deze weg. Verzamel de onderste reticulaire dermis (“dermale laag 3”, Figuur 2) in een ander Petri schaaltje. Ga onmiddellijk naar sectie 4 of Voeg 1x PBS toe om het weefsel te houden van het uitdrogen.Opmerking: Als alternatief, in plaats van schrapen het vet af met een scalpel, verwijder het vet laag met een schaar. Het kan helpen om de reticulaire dermis op ijs te zetten voorafgaand aan het schrapen van het vet weg. 3. scheiding van epidermis en dermis Bereid een 3 U/mL scheidend enzym (d.w.z., Dispase II) oplossing in steriele 1x PBS voor. Plaats de 5 mm huid strepen (uit deel 1), of de epidermis/papillaire dermis (vanaf stap 2,2), met de epidermis naar boven gericht in een 10 cm Petri schaaltje met 10 mL van 3 U/mL scheidende enzym oplossing. Incubeer de Petri schaal bij 37 °C voor 1 h. Het protocol kan hier worden onderbroken. Incubeer epidermis/papillaire dermis in protease in de ijskast bij 4 °C ‘s nachts in plaats daarvan. Zo nodig slaan de andere lagen (dermale laag 1, 2 en 3) overnachting ondergedompeld in 1x PBS in 50 mL buizen bij 4 ° c.Let op: Werk zorgvuldig met protease, kan het irriteren huid en ogen bij contact. Na incubatie, de overdracht van de epidermis/papillaire dermis aan de droge deksel van de Petri schaal en scheiden van de epidermis van de bovenste dermis (dermale laag 1) met twee Tang elk bedrijf de rand van ofwel de epidermis of dermis. 4. enzymatische vertering van huidweefsel Hak elke dermale laag (dermale laag 1, 2 en 3) afzonderlijk met een schaar/scalpel zo grondig mogelijk; Hoe kleiner de stukken, hoe beter de weefsel spijsvertering.Opmerking: De taaiheid van de dermis kan variëren, afhankelijk van het lichaamsdeel het afkomstig is van (bijv., abdominale of bovenarm huid). Bereid de spijsvertering mix door het combineren van 1,25 mg/mL Collagenase I, 0,5 mg/mL Collagenase II, 0,5 mg/mL Collagenase IV en 0,1 mg/mL hyaluronidase in Dulbecco gemodificeerde adelaar ‘s medium (DMEM) met L-glutamine (Zie tabel van materialen), 10% foetale kalf serum ( FCS) en 1% penicilline/streptomycine (P/S).Let op: Werk zorgvuldig met collagenases aangezien deze huid en ogen bij contact kunnen irriteren. Zet elk van de gehakte weefsels met 10 mL van de bereide spijsvertering mix in een 50 mL buis en incubeer in een 37 °C warmwaterbad voor 1 uur onder permanente agitatie. Tijdens de spijsvertering omkeren de buizen meerdere malen.Opmerking: Men zou moeten nadenken aanpassend het spijsverterings volume volgens de grootte van het gehakte huid stuk. Niet overbelasten 10 mL spijsvertering mix met te veel weefsel anders de cel opbrengst zal minimaal zijn. Minder dan een derde van het weefsel binnen het totale volume wordt aanbevolen (1:2 w/v). 5. voorbereiding van een enkele cel schorsing en bezinking Lysis Stop enzymatische weefsel spijsvertering door toevoeging van 10 mL fibroblast medium (DMEM met L-glutamine, 10% FCS en 1% P/S) aan het verteerde weefsel. Werk op ijs vanaf hier. Giet de inhoud van elke buis door middel van een regelmatige steriele roestvrij Theezeef en het verzamelen van cel schorsing in een schone Petri schaaltje. Was de zeef met medium en mash onverteerd weefsel stukken met de rand van een spuit-plunjer. Daarna, pipet verzameld cel schorsing door middel van een 70 µm cel zeef in een 50 mL buis. Spoel de cel zeef met medium en het verzamelen van stroom door in dezelfde buis. Centrifugeer buizen bij 500 x g bij 4 °c voor 10 min. Verwijder en gooi bovendrijvende en was Cell pellet met 5 ml fibroblast medium. Herhaal de centrifugale stap. Verwijder en gooi de bovendrijvende en de pellet opnieuw op te schorten in 1 mL self-made ACK bezinking lysis buffer (0,15 M NH4cl, 10 mm KHCO3, 0,1 mm na2EDTA; pH 7.2 \ u 20127.4). Laat de cellen in lysis buffer ongeveer 1 min bij omgevingstemperatuur (20 \ u201222 °C). Stop lysis door toevoeging van 9 mL 1x PBS met 10% FCS en centrifugeer de tubes opnieuw bij 500 x g bij 4 °c gedurende 5 min. Gooi de bovendrijvende weg.Let op: De incubatietijd in lysis kan worden aangepast als de lysis lijkt onvolledig (rode pellet). Echter, laat de cellen in de bezinking lysis buffer te lang om te voorkomen dat Lysis van fibroblasten en immuun cellen. 6. blokkeren en kleuring fibroblasten voor FACS Bereid 5 µ L van de mens FC-receptor blokkering oplossing in 100 µ L van 1x PBS met 10% FCS en opnieuw op te schorten cellen in 100 µ L van de mens FC blocker. Incubeer op ijs voor 10 min. Ontwerp een FACS kleurplaat om de menselijke dermale fibroblasten te bevlekken. Meng anti-humaan FAP APC (1:20), anti-humaan CD90 AF700 (1:30), Anti-menselijke E-cadherine PE (1:20), Anti-menselijke CD31 FITC (1:30), anti-menselijk CD45 vreedzaam blauw (1:20), anti-menselijk ITGA6 PE (1:20), anti-menselijk CD235ab vreedzaam blauw (1:1000) en anti-mens CD106 de Stille Oceaan blauw (1:100) in 1x PBS met 10% FCS. Na het blokkeren van de receptor van FC, spin cellen neer bij 500 x g bij 4 °c voor 3 min. Verwijder en negeer de bovendrijvende en hersuspendeer cellen in 100 µ l van antilichamen mengeling. Incubeer cellen in het donker bij 4 °C gedurende 20 min. Verwijder vóór de kleuring 20 µ L van een monster met een hoog cellen nummer voor ongekleurd en enkele vlek FACS controles. Was de bevlekte cellen en FACS controles tweemaal met 500 µ L 1x PBS met 10% FCS en centrifuge bij 500 x g bij 4 °c 3 min. In de tussentijd, Voeg 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tot 1x PBS met 10% FCS om een definitieve concentratie van 1 µ g/mL te maken. Verwijder en gooi bovendrijvende, opnieuw op te schorten cellen in 200 µ L DAPI oplossing en filter elke cel schorsing door middel van een 70 µm cel zeef in een 5 mL FACS buis.Opmerking: Als FACS zal worden uitgevoerd met vertraging, voeg DAPI en filter kort voor de opname. 7. gating strategie voor menselijke dermale fibroblast subset isolatie en FACS Record flow Cytometry controles, stel de juiste voltage-instellingen en het uitvoeren van de juiste compensatie. Poort voor enkelvoudige cellen en Live (DAPI-), Pacific Blue, PE en FITC negatieve cellen (CD45-, CD31-, CD235ab-, CD106-, ITGA6- en E-cadherine-) om drie fibroblast populaties te krijgen: FAP+ CD90-, FAP+CD90+ en FAP-CD90+ cellen. Zie Figuur 3. Sorteer drie fibroblast sub-populaties in aparte 1,5 mL schroef dop microcentrifuge tubes gevuld met 350 µ L lysis buffer voor RNA isolatie of gevuld met 350 µ L fibroblastgroei medium (Zie de tabel van materialen) voor de cel cultuur. Omkeren buizen onmiddellijk na het sorteren en ofwel zet lysis buffer buizen in vloeibare stikstof voor Snap bevriezing of zet middelgrote buizen op het ijs.Let op: Bereid lysis buffer met 0,1% b-mercaptoethanol in rook kap en vermijd inademing. 8. kweken van fibroblasten en Adipogenesis assay Na FACS, spin cellen neer bij 500 x g voor 3 min bij 4 °c en plaat gelijke cel aantallen (5000 \ u201210, 000 cellen/goed) in fibroblastgroei middel (Zie de lijst van materialen) in 48-goed de cultuur schotels van de cel. Laat de cellen groeien tot ze 70% confluentie te bereiken. Voeg 5 µ g/mL insuline, 5 µ M troglitazone, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) en 1 µ M dexametasone aan fibroblastgroei medium om adipocyte differentiatie medium voor te bereiden. Vervangmiddel van de gekweekte cellen met adipocyte differentiatie middel en laat cellen voor 14 dagen onderscheiden. Exchange medium na dag 2 met verminderde adipogenesis medium met 5 µ g/mL insuline en 5 µ M troglitazone. Vullen medium elke 3RD of 4th dag. Bevestig cellen met 4% voor 20 min bij omgevingstemperatuur (20 \ u201222 °C) bij differentiatie dag 14. Was de putten met 60% isopropanol en laat het volledig verdampen. Vlek cellen met 5 mM olie rood O (filter voorafgaand aan gebruik) voor 20 min. wassen gekleurd cellen vier keer met gedistilleerd water. Gaan om microscopie uit te voeren.Let op: Het is giftig en schadelijk. Voorzichtig te behandelen.Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. Vaste cellen kunnen worden opgeslagen in 1x PBS bij 4 ° c tot olie rood O kleuring wordt uitgevoerd. Cover schotel met paraffine folie voorafgaand aan de opslag om verdamping te voorkomen. Beeld cellen ondergedompeld in water met een omgekeerde Microscoop bij 10x vergroting met doorgegeven licht.

Representative Results

Een overzicht van de belangrijkste stappen voor de verwerking van huidweefsel voor het verkrijgen van een enkele schorsing van de cel wordt weergegeven in Figuur 1, het weergeven van de dermatoming van de huid (Figuur 1a), verschillende dermale lagen (Figuur 1b), verwijdering van het onderhuidse vet laag (figuur 1c) en de scheiding van de epidermis en papillaire dermis (figuur 1d), evenals de verschillende stappen van de handleiding en enzymatische weefsel dissociatie (Figuur 1e, F). Een schema van de drie dermale lagen is voorzien in Figuur 2. Figuur 3 toont de gating strategie van een flow Cytometry kleuring paneel voor de analyse van verschillende fibroblast deelverzamelingen van de menselijke huid. Extra oppervlakte markers die niet worden uitgedrukt op fibroblasten toestaan dat de uitsluiting van verschillende andere cellen aanwezig zijn in de huid, zoals immuun cellen, epidermale cellen, mesenchymale stamcellen (MSCs), rode bloedcellen of endothelial cellen te bereiken maximale zuiverheid in de geïsoleerde populaties. Het is niet van cruciaal belang om de identieke FACS paneel gebruikt in Figuur 2 te gebruiken voor de identificatie van deze fibroblast subpopulaties, maar dit is onze aanbeveling. Men kan antilichamen gebruiken die met verschillende fluorescente kleurstoffen worden geëtiketteerd of de combinatie van uitsluitings tellers veranderen. Van de nota, dit protocol maakt de identificatie van drie fibroblast populaties in de menselijke huid die aanwezig zijn met verschillende intradermale lokalisatie, genexpressie profielen en ook functies (Figuur 4). FAP+CD90- zijn verrijkt in de papillaire DERMIS overwegende dat FAP+CD90+ en FAP-CD90+ zijn meer overvloedig in de reticulaire dermis (figuur 4a). Alle drie sub-bevolkingen vertonen de typische fibroblast morfologie bij het sorteren in de cultuur van de cel (figuur 4b). Interessant, verschillen zij betreffende hun capaciteit om in adipocyten te onderscheiden die een stempel voor reticulaire fibroblasten is. Het combineren van deze resultaten met genexpressie profilering via real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)16 (figuur 4c), waaruit blijkt dat FAP+CD90- cellen Express hoge niveaus van markers algemeen toegeschreven aan papillaire fibroblasten zoals CD26, NTN en PDPN, terwijl CD90+ cellen Express de bekende reticulaire markers zoals CD36, ACTA2 en PPARγ op een hoog niveau, concluderen we dat FAP+CD90- cellen behoren tot de papillaire en CD90+ cellen behoren tot de reticulaire Lineage. Figuur 1: isolatie van dermale enkele cel schorsing van intacte menselijke huid. (A) dehuid wordt gesneden met een elektrische dermatoom in papillaire en reticulaire dermis. (B) papillaire dermis met aangrenzende epidermis is 300 µm dik (bovenkant) terwijl de hogere reticulaire dermis 700 µm dik (bodem) is. (C) onderhuids vet laag is afgeschraapt-off van de onderste reticulaire dermis met een scalpel. (D) na incubatie van papillaire dermis in dissociatie enzym oplossing bij 37 °c voor 1 h, de epidermis kan gemakkelijk worden verwijderd met een tang. Everschillende huidlagen worden gehakt met een schaar en overgebracht naar een enzym digestie mengsel bestaande uit Collagenase I, II en IV en hyaluronidase. (F) na 1 h van dissociatie bij 37 °c, wordt de weefsel spijsvertering tegengehouden en de opschorting wordt gegoten door een theezeef om onverteerde huid stukken te verwijderen. (G) cel schorsing wordt opnieuw gefilterd door middel van een 70 µm cel zeef en centrifuge bij 500 x G bij 4 ° c gedurende 10 min. (H) na centrifugeren, wordt de cel pellet gewassen met 1x PBS met 10% FCS en is klaar voor FACS kleuring. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: sectie van de menselijke huid dermis in papillaire en reticulaire lagen met een dermatoom. Schema met de drie dermale lagen verkregen door het snijden van de volledige dikte huid in papillaire dermis (met inbegrip van epidermis; 0 \ u2012300 µm; dermale laag 1), bovenste reticulaire (300 \ u20121, 000 µm; dermale laag 2) en lagere reticulaire dermis (> 1000 µm; dermale laag 3) met een Dermatoom. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: FACS gating strategie voor menselijke dermale fibroblast subpopulaties. (A\u2012E) Ten eerste, cellen zijn gated op single (B) en levensvatbare (DAPI-) cellen (C). De immune cellen (CD45+), mesenchymale stamcellen (CD106+), rode bloedcellen (CD235ab+) zijn uitgesloten (C) en de vreedzame blauwe negatieve cellen zijn verder omheind op E-cadherine (ECAD) en ITGA6 dubbele negatieve cellen (PE kanaal, D ). E-cadherine en ITGA6 zijn markeringen die op epidermale cellen worden uitgedrukt. Volgende, CD31-FITC positieve cellen (endothelial en lymfe cellen) zijn uitgesloten (D) resulterend in drie fibroblast populaties uiten ofwel een of beide van de twee cellen oppervlak fibroblast markers FAP en CD90: FAP+CD90-, FAP+CD90+ en FAP-CD90+ (E). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: FAP+CD90-, FAP+CD90+ en FAP-CD90+ fibroblasten verschillen in dermale lokalisatie, genexpressie en functionaliteit. (A) representatieve FACS percelen van gated fibroblasten geïsoleerd van papillaire, bovenste reticulaire en lager reticulaire dermis. Gating strategie wordt toegelicht in Figuur 3. FAP+CD90- fibroblasten zijn verrijkt in de papillaire dermis (19,2%) vergeleken met lagere reticulaire dermis (0,83%). FAP+CD90+ cellen kunnen worden gevonden in de dermis, maar hun hoogste overvloed is in de bovenste reticulaire dermis (40,7%). FAP-CD90+ zijn verrijkt in de onderste reticulaire dermis (64,4%). (B) van de nota, alle drie de gesorteerde subpopulaties weer te geven typische fibroblast morfologie op cultuur voor 7 dagen (links). Interessant, gedragen zij zich verschillend in een adipogenesis assay. Na 14 dagen in de cultuur, FAP+CD90- niet differentiëren in adipocyten terwijlFAP +CD90+ en FAP-CD90+ gemakkelijk ondergaan adipogenesis (rechts; Olie rood O vlekken lipide-dragende cellen rood). Weegschaal staven = 1.000 µm. (C) direct gesorteerd FAP+CD90- fibroblasten Express de PAPILLAIRE fibroblast markers CD26, NTN1 en PDPN, terwijl FAP-CD90+ cellen Express CD36, ACTA2 en PPARγ, waarvan bekend is dat uitgedrukt door de reticulaire Lineage. * p ≤ 0,05; p ≤ 0,0005 in vergelijking met FAP+/CD90- cellen; # p ≤ 0,05; # # # p ≤ 0,0005 in vergelijking met FAP-/CD90+ cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

In dit artikel beschrijven we een methode voor het isoleren van papillaire en reticulaire fibroblasten van de menselijke huid. CD90 is op grote schaal gebruikt voor de identificatie of isolatie van dermale fibroblasten18,20,21. We hebben echter aangetoond dat naast CD90 + fibroblasten, de menselijke dermis ook havens een CD90– fibroblast bevolking uitdrukken FAP16, die is opgericht als een marker voor geactiveerde fibroblasten en kanker-geassocieerde fibroblasten ( CAFs)22,23,24,25. Belangrijker, we waren in staat om drie fibroblast subpopulaties FAP+CD90–,FAP +CD90+ en FAP–CD90+ in de huid Biopten van alle gezonde menselijke donoren te identificeren. We concluderen daarom dat FAP is niet alleen een marker voor geactiveerde fibroblasten of CAFs maar ook normaal weefsel fibroblasten.

Van de nota, de FAP–CD90– Cell bevolking die na toepassing van de hierboven beschreven uitsluiting-en gating strategie bevat geen fibroblasten, omdat deze cellen niet vermenigvuldigen in fibroblast teeltmedium in vitro, maar de meeste waarschijnlijk een gemengde cel populatie met inbegrip van lymfe cellen en pericyten onder andere16.

De cel opbrengst die door gebruik van bovengenoemd protocol wordt verkregen kan variëren afhankelijk van het lichaamsdeel dat het huid stuk dat voor de isolatie wordt gebruikt voortkomt uit. Dermis van verschillende lichaamsdelen verschilt betreffende zijn structuur, dikte evenals collageen samenstelling. Bijvoorbeeld, de huid van het gezicht of de bovenarm is veel dunner dan de huid van de buik of de dij, die ook vaak weer een dikkere onderhuidse vet laag. Bovendien, leeftijd en geslacht van de huid donoren kan verder niet alleen invloed op de weefsel dissociatie efficiëntie, maar kan ook invloed hebben op de verdeling van de drie fibroblast subpopulaties (Figuur 3) wanneer geïsoleerd van de volledige dikte huid. Dit vloeit voort uit het feit dat papillaire dermis krimpt en dat de totale aantallen van de Fibroblast daling met leeftijd11,26,27,28. Bovendien zal de cel pellet van papillaire dermis waarschijnlijk groter zijn dan van reticulaire dermis, aangezien de bovenste dermis is meer dicht bevolkt door fibroblasten dan de reticulaire dermis. Bovendien, lagere dermis is ook taaier en meer dicht ingepakt met collageen, die het moeilijker maakt om het weefsel te scheiden en de fibroblasten vrij te geven. Van de nota, kan de cel pellet lijken erg rood, dat is de reden waarom rode bloedcel lysis wordt aanbevolen.

Naast de identificatie van drie sub-bevolkingen in intacte menselijke huid, tonen wij ook aan dat in dermatomed huid, elke fibroblast ondergroep of in papillaire of reticulaire dermis16wordt verrijkt. Het nauwkeurige snijden van de huid met dermatoom is essentieel om een juiste verrijking van elke subpopulatie van verschillende huidlagen te verkrijgen. Aangezien de papillaire dermis is zeer dun, de dermatomed Slice die het mag niet hoger zijn dan een dikte van 300 µm. bovenste reticulaire en lagere reticulaire fibroblasten beide vertegenwoordigen de reticulaire lijn en weer te geven soortgelijke functies en gen handtekeningen, Daarom zou men ook kunnen overwegen niet te scheiden.

Belangrijker, alle drie de fibroblasten populaties zijn te vinden in de dermis en zijn niet uitsluitend aanwezig in een laag, dat is de reden waarom explant culturen uit papillaire of reticulaire dermis resulteren in gemengde fibroblast culturen. Echter, FAP+CD90– papillaire fibroblast zijn het meest overvloedig in de papillaire dermis en volg een gradiënt van oppervlakkig naar lagere dermale lagen, terwijl FAP+CD90+ en FAP–CD90+ fibroblasten volgen een omgekeerde gradiënt van lager aan oppervlakkige lagen16. Bovendien is de meerderheid van de CD90+ fibroblasten van de papillaire dermis bijna uitsluitend gevonden rond de bloedvaten en Express de perivasculaire FIBROBLAST marker CD14629, en dus waarschijnlijk vertonen verschillende functies dan de het blijven CD146– reticulaire fibroblasten16. CD146 kan worden gebruikt als een extra marker in de gating strategie om deze populatie uit te sluiten.

Na de dissociatie van dermale lagen, zijn de geïsoleerde cellen gekleurd met een speciaal ontworpen antilichaam cocktail met verschillende antilichamen voor de uitsluiting van immuun cellen, endothelial en lymfe cellen, epidermale cellen, bezinkingen en MSCs om verkrijgen van pure fibroblast populaties. Van de nota, het kiezen van een marker voor de identificatie en uitsluiting van MSCs kan lastig zijn vanwege het hoge aantal gepubliceerde MSC markers30,31. Sinds MSCs Express CD90 zoals fibroblasten, kunnen extra MSC markers zoals CD105 of CD271 nuttig blijken voor hun identificatie. Echter, MSCs vertegenwoordigen slechts een zeer laag percentage van alle dermale cellen en sinds CD90+ fibroblasten display typische morfologische kenmerken van fibroblasten bij het sorteren, zou men kunnen stellen dat de uitsluiting van MSCs door het gebruik van verschillende oppervlakte markers cel zou kunnen onnodig zijn.

Belangrijk, analyseerden wij FAP en CD90 gen uitdrukking na het houden van de cellen in cultuur voor 7-14 dagen na het sorteren (gegevens niet getoond) en vonden dat de uitdrukking van beide tellers in respectieve gesorteerde enige positief (FAP+CD90– of FAP–CD90+) cellen16. Wij benadrukken daarom dat de hierboven beschreven marker sets en het protocol het mogelijk maken de isolatie van primaire fibroblast subsets rechtstreeks uit het weefsel, maar niet van eerder gekweekte gemengde fibroblast populaties.

Niettemin, tonen wij aan dat de functionaliteit van alle drie sub-bevolkingen in de cultuur van de cel ongeacht de wijziging van de markerings uitdrukking van de cel oppervlakte wordt behouden, aangezien fibroblasten gesorteerd als FAP+CD90– papillaire fibroblasten niet verwerven van de mogelijkheid om adipogenesis ondergaan na een langere periode van cultuur, terwijl fibroblasten gesorteerd als FAP+CD90+ of FAP–CD90+ reticulaire fibroblasten handhaven hun vermogen om te differentiëren in adipocyten 16 . Belangrijk is, vonden we ook dat papillaire en reticulaire-specifieke genen nog steeds worden uitgedrukt in een hogere mate in FAP+CD90– en CD90+ respectievelijk.

Samenvattend, hebben wij een protocol voor de isolatie van functioneel DISTINCT fibroblast ondergroepen via FACS gevestigd die voor het eerst de isolatie en de analyse van zuivere en naïeve fibroblast subpopulaties van menselijke huid dermis toelaat. Deze methode vestigt een belangrijke vordering aan het algemeen gebruikte fibroblast explant de isolatie Protocol van de cultuur van hogere en lagere dermis zoals (i) een verzettende gradiënt van papillaire en reticulaire fibroblasten bestaat van de huidoppervlakte aan dermis en (II) fibroblasten veranderen hun gen handtekening in vitro.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij erkennen dankbaar hulp bij FACS-sortering door Bärbel Reininger en Wolfgang Bauer. Dit werk werd gesteund door toelagen aan B. M. L. van het Oostenrijkse wetenschaps Fonds (FWF: V 525-B28), en de Federatie van Europese biochemische maatschappijen (FEBS, het onderzoek Fonds van de follow-up). S. F. is de ontvanger van een DOC Fellowship van de Oostenrijkse Academie van Wetenschappen (OeAW). Wij zijn dankbaar voor de uitstekende ondersteuning van de kernfaciliteiten van de medische universiteit van Wenen. Wij danken Bernhard Gesslbauer, Christine Rijckaert en Martin Vierhapper voor het verstrekken van menselijk huidmateriaal.

Materials

Material:
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
Ammonium chloride Sigma 9718 used for selfmade ACK Lysis Buffer
Amniomax-C100 (1x) Basal Medium Gibco 17001-074 used for fibroblast growth medium
β-Mercaptoethanol Scharlau ME0095 ! CAUTION
C100 Supplement Thermo Scientific 12556015 used for fibroblast growth medium
Collagenase I Thermo Scientific 17100017 ! CAUTION
Collagenase II Gibco 17101015 ! CAUTION
Collagenase IV Sigma C5138 ! CAUTION
DAPI Thermo Scientific 62248
Dexamethasone Sigma D8893
Dispase II Roche 4942078001 ! CAUTION
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX Gibco 31966-021
EDTA disodium salt Sigma E1644 used for selfmade ACK Lysis Buffer
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco 10500-064
Hyaluronidase Sigma H4272 ! CAUTION
Insulin Sigma I5500
Isopropanol Merck 1,096,341,011
OilRed O Sigma O-0625
Paraformaldehyd Sigma 158127 ! CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care.
Penicillin/Streptomycin Gibco 15070-063
Phosphate-buffered saline without Ca++ & Mg++ Lonza BE17-512F
Potassium bicarbonate Sigma 237205 used for selfmade ACK Lysis Buffer
PureLink RNA MicroKit Invitrogen 12183-016
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR Invitrogen 11752
Taqman 2xUniversal PCR Master Mix Applied Biosystems 4324018 ! CAUTION Skin and eye irritant.
Troglitazone Sigma T2573
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry Antibodies:
anti human CD31-AF488 Biolegend 303109 Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075
anti human CD45-Pacific blue Biolegend 304029 Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123
anit human CD49f/ITGA6-PE Serotec MCA699PE Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833
anti human CD90/Thy-1-AF700 Biolegend 328120 Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302
anti human CD106-AF421 BD 744309 Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x
anti human CD235ab-Pacific blue Biolegend 306611 Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153
anti-human E-cadherin-PE Biolegend 147304 Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040
anti human FAP-APC R&D FAB3715A Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x
Human TruStain FcX Biolegend 422302 Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x
Name Company Catalog Number Comments
Equipment:
1.4 mL micronic tubes Thermo Scientific 4140
1.5 mL screw cap micro tube Sarstedt 72,692,405
5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap Falcon 352235
48-well cell culture cluster Costar 3548
50 mL polypropylene canonical tubes Falcon 352070
70 µm cell strainer nylon Falcon 352350
Aesculap Acculan 3Ti Dermatome VWR AESCGA670
Aesculap Dermatome blades VWR AESCGB228R
MicroAmp Fast Optical 96well Applied Biosystems 4346906
Primary cell culture dish Corning 353803
Scalpel blades F.S.T 10022-00
Tea strainer x x
Name Company Catalog Number Comments
Fibroblast growth medium:
AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10 % FCS and 1 % P/S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of Cell Science. 117 (Pt 5), 667-675 (2004).
  2. Lowry, W. E., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2883-2888 (2008).
  3. Kisseleva, T. The origin of fibrogenic myofibroblasts in fibrotic liver. Hepatology. 65 (3), 1039-1043 (2017).
  4. LeBleu, V. S., et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis. Nature Medicine. 19 (8), 1047-1053 (2013).
  5. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulation Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  6. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
  7. Rinkevich, Y., et al. Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), (2015).
  8. Abhishek, S., Palamadai Krishnan, S. Epidermal Differentiation Complex: A Review on Its Epigenetic Regulation and Potential Drug Targets. Cell Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
  9. Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
  10. Mastrogiannaki, M., et al. beta-Catenin Stabilization in Skin Fibroblasts Causes Fibrotic Lesions by Preventing Adipocyte Differentiation of the Reticular Dermis. Journal of Investigative Dermatology. 136 (6), 1130-1142 (2016).
  11. Lichtenberger, B. M., Mastrogiannaki, M., Watt, F. M. Epidermal beta-catenin activation remodels the dermis via paracrine signalling to distinct fibroblast lineages. Nature Communications. 7, 10537 (2016).
  12. Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204 (4392), 526-527 (1979).
  13. Hiraoka, C., et al. Two clonal types of human skin fibroblasts with different potentials for proliferation and tissue remodeling ability. Journal of Dermatological Science. 82 (2), 84-94 (2016).
  14. Higgins, C. A., et al. Multifaceted role of hair follicle dermal cells in bioengineered skins. Br Journal of Dermatology. 176 (5), 1259-1269 (2017).
  15. Korosec, A., Lichtenberger, B. M., Marques, A. P., Pirraco, R. P., Cerqueira, M., Reis, R. L. Ch. 12. Skin Tissue Models. , 279-301 (2017).
  16. Korosec, A., et al. Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin. Journal of Investigative Dermatology. , (2018).
  17. Higgins, C. A., Chen, J. C., Cerise, J. E., Jahoda, C. A., Christiano, A. M. Microenvironmental reprogramming by three-dimensional culture enables dermal papilla cells to induce de novo human hair-follicle growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19679-19688 (2013).
  18. Philippeos, C., et al. Spatial and Single-Cell Transcriptional Profiling Identifies Functionally Distinct Human Dermal Fibroblast Subpopulations. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).
  19. Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
  20. Jiang, D., Rinkevich, Y. Defining Skin Fibroblastic Cell Types Beyond CD90. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 133 (2018).
  21. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International Review of Cell and Molecular Biology. , 161-214 (2009).
  22. Huang, Y., et al. Isolation of Fibroblast-Activation Protein-Specific Cancer-Associated Fibroblasts. BioMed Research International. 2017, 4825108 (2017).
  23. Jiang, G. M., et al. The application of the fibroblast activation protein alpha-targeted immunotherapy strategy. Oncotarget. 7 (22), 33472-33482 (2016).
  24. Pure, E., Blomberg, R. Pro-tumorigenic roles of fibroblast activation protein in cancer: back to the basics. Oncogene. 37 (32), 4343-4357 (2018).
  25. Hamson, E. J., Keane, F. M., Tholen, S., Schilling, O., Gorrell, M. D. Understanding fibroblast activation protein (FAP): substrates, activities, expression and targeting for cancer therapy. PROTEOMICS – Clinical Applications. 8 (5-6), 454-463 (2014).
  26. Gilchrest, B. A. A review of skin ageing and its medical therapy. Br Journal of Dermatology. 135 (6), 867-875 (1996).
  27. Gilchrest, B. A., Krutmann, J. . Skin Aging. , 198 (2006).
  28. Makrantonaki, E., Zouboulis, C. C. Molecular mechanisms of skin aging: state of the art. Annals of the New York Academy of Sciences. 1119, 40-50 (2007).
  29. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  30. Kundrotas, G. Surface markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts. Acta Medica Lituanica. 19 (2), 75-79 (2012).
  31. Lupatov, A. Y., Vdovin, A. S., Vakhrushev, I. V., Poltavtseva, R. A., Yarygin, K. N. Comparative analysis of the expression of surface markers on fibroblasts and fibroblast-like cells isolated from different human tissues. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 537-543 (2015).

Tags

Keyword Extraction:Papillary FibroblastsReticular FibroblastsHuman SkinFluorescence-activated Cell SortingFACSDermal Fibroblast SubsetsSkin PathologiesCancerInflammatory Skin DiseasesFull-thickness DermisSubcutaneous Fat LayerPapillary DermisReticular DermisEnzymatic DigestionDissociating Enzyme Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Korosec, A., Frech, S., Lichtenberger, B. M. Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (147), e59372, doi:10.3791/59372 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image