냉동 제브라피시 배아의 순차적 면역형광 및 면역성화학

1. 배아 준비 48시간 후 수정 후 수정(hpf) 키메라 제브라피쉬 배아를 AB 야생형 제브라피쉬 배아 에서 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 배반-블라스쿨라 이식에 의해 생성된 4°C에서 흔들어. 비이온 계면활성제 0.1%를 함유한 1x 인산완충 식염수 500μL을 사용하여 실온에서 흔들림으로 2개의 5분 세척을 수행합니다(1x PBSt; 재료 표참조)참고: 파라포름알데히드는 독성이 있으며 발암물질이며 기관 규정당 적절히 폐기해야 합니다. 파라포름알데히드와 함께 작업하는 것은 화학 후드에서 수행되어야하며, 적절한 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 코트 및 안전 안경)를 항상 사용해야합니다. 배아를 30% 30%, 50%, 70% 메탄올(MeOH)으로 순차적으로 세척하여 1x PBSt로 10분 동안 희석하여 실온에서 흔들림으로 탈수한다. 배아를 -20°C에서 100% MeOH의 500 μL에서 배아를 14시간 이상 배양한다.참고: 메탄올은 독성이 있으며 기관 규정에 따라 적절히 폐기해야 합니다. 메탄올작업은 화학적 후드에서 수행해야 하며, 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험실 코트 및 안전 안경)를 항상 사용해야 합니다. 500 μL의 70%, 50%, 30%의 MeOH로 순차적으로 세척하여 배아를 1x PBSt로 10분 동안 흔들어 서 재수화합니다. 실온에서 500 μL의 1x PBSt로 2개의 5분 세척을 수행합니다. 1x PBSt를 제거하고 배아가 튜브의 바닥으로 가라 앉을 때까지 흔들면서 실온에서 탈이온수로 희석된 30% 자당의 500 μL에서 배양합니다(약 1시간). 자당을 15 % 생선 젤라틴 / 25 % 자당 (15 /25; 재료 표참조)의 500 μL로 교체하고 하룻밤 흔들어 실온에서 배양하십시오. 15/25 부피의 약 절반을 최적의 절삭 온도 매체(OCT medium)로 교체하고 배아가 튜브 바닥(약 1시간)에 가라앉을 때까지 실온에서 배양합니다. 부피의 약 절반을 OCT 배지로 교체하고 실온에서 1 시간 동안 흔들면서 배양하십시오. 15/25 및 OCT 배지로 인큐베이션 단계에서, 이러한 시약을 결합하기 위해 필요에 따라 튜브를 반전 또는 플릭. 2. 배아 삽입 및 냉동 섹션의 준비 배아를 집게로 플라스틱 몰드(재료 표참조)로 옮기고 15/25-OCT 혼합물의 전달을 최소화합니다. 100만 개 배지로 곰팡이를 약 반으로 채우고 배아를 OCT 배지로 부드럽게 섞는다. 라벨이 부착된 플라스틱 몰드를 준비하고 원하는 배아(보통 1\u20123 배아)를 빈 라벨이 부착된 플라스틱 몰에 옮겨 OCT 배지의 이월을 최소화합니다. 원하는 배아가 플라스틱 몰드에 들어가면, OCT 배지를 곰팡이 의 상부로 부드럽게 채웁니다. 집게 또는 25 G 바늘을 사용하여 배아를 원하는 방향으로 배열하고, 시각화를 위해 가벼운 입체 현미경을 사용한다(그림1A,B). 금속 플랫폼으로 절연 용기에 드라이 아이스에 준비 된 금형을 동결. 얼음 양동이 또는 거품 쿨러를 금속 플랫폼에 부드럽게 놓아 차가운 챔버를 만듭니다 (그림1C,D) -20°C에 설정된 저온 극저온을 사용하여 10\u201212 μm 두께의 저온 절을 준비합니다. 한 번에 하나의 블록을 설정하고 OCT 매체를 사용하여 블록을 블레이드를 향하도록 블록의 하단과 함께디스크/척에 고정합니다(그림 2A). 단면화(그림 2B)를 시작하기 전에 블록이 디스크에 완전히고정되어 있는지 확인합니다(OCT 매개체가 흰색으로 바뀝니다). 충전된 유리 슬라이드(그림2C,D)에 저온 절을 놓고 실온에서 밤새 슬라이드를 공기 건조시. 3. pH3에 대한 면역 형광 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 1x PBS로 슬라이드의 3개의 5분 세차량을 수행합니다. 조직이 슬라이드에 잘 부착되지 않은 경우, 평평한 표면에 슬라이드를 놓고 표면에 1x PBS의 500 μL을 부드럽게 피펫팅하여 세안을 수행하십시오. 슬라이드를 부드럽게 팁하여 세안 사이에 1x PBS를 붓습니다. 슬라이드에 액체를 유지하기 위해 배리어 펜이나 왁스연필로 섹션을 윤곽을 그립니다(그림 3). 밀기 챔버에 평평한 표면에 슬라이드를 놓고 슬라이드에 섹션 당 블록 버퍼의 파이펫 200 μL. 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 블록 버퍼로 배양합니다. 1차 항체 희석(토끼 항-pH3 항체, 1:200; 물질표참조)을 블록 완충액으로 준비하고 파이펫팅하여 잘 섞는다. 슬라이드를 부드럽게 팁하여 블록 버퍼를 빼내고 습한 챔버로 되돌리고 섹션당 1차 항체 용액의 파이펫 200 μL을 슬라이드에 밀어 넣습니다. 보조 전용 컨트롤의 경우, 파이펫 200 μL의 블록 버퍼를 해당 섹션에. 탈이온수로 채워진 습한 챔버에서 밤새 4°C에서 슬라이드를 인큐베이션합니다. 습기가 많은 챔버의 가장자리를 밀봉하여 수분을 유지합니다. 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 1x PBS로 슬라이드의 3개의 5분 세차량을 수행합니다. 세척 단계 동안, 이차 항체 희석(항토끼 형광 이차 항체 컨쥬게이트, 1:2,000; 재료 표참조)을 블록 완충액으로 준비하고 파이펫팅하여 잘 혼합한다. 밀기 챔버에 평평한 표면에 슬라이드를 놓고 슬라이드에 섹션 당 이차 항체 용액의 파이펫 200 μL. 30 분 동안 빛으로부터 차폐 된 실온에서 이차 항체 용액으로 슬라이드를 배양하십시오. 빛으로부터 차폐된 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 1x PBS로 슬라이드의 3개의 5분 간 세차서를 수행합니다. 세척 단계에서 핵 염색 용액을 준비합니다(재료 표참조). 핵 염색 용액의 평평한 표면과 파이펫 200\u2012500 μL(시료 크기에 따라 다름)에 슬라이드를 각 섹션에 놓습니다. 빛으로부터 차폐된 10분 동안 핵 염색 용액에 슬라이드를 인큐베이션합니다. 핵 염색 용액을 빼내고 미경화 형광 장착 매체와 유리 커버슬립으로 슬라이드를 장착합니다. 이미징이 수행될 때까지 어두운 환경에서 슬라이드를 4°C로 유지합니다.참고: 슬라이드가 같은 날 또는 다음 날에 이미지화될 때 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. IF에 이어 100배 배율(10x 구형 배율 및 10배 객관적 배율)에서 555 nm(적색) 및 645nm(원적) 방출 필터를 사용하여 공초점 형광 현미경 및 디지털 카메라로 슬라이드를 시각화하고 이미지화합니다. 이미징 전반에 걸쳐 레이저 파워를 일관되게 유지합니다. 이미징 후 슬라이드를 1x PBS의 개별 용기에 놓고 밤새 4°C에서 평평하게 보관하여 커버슬립 제거를 준비합니다. 슬라이드를 1x PBS에 배치할 때 슬라이드를 부드럽게 교반하여 커버슬립을 제거하는 데 도움을 주십시오.참고: 커버슬립을 누르거나 커버슬립을 수동으로 제거하지 마십시오. 커버슬립은 최소한의 강제 이동으로 수평으로 제거해야 합니다. 4. 표지된 덱스렌을 위한 면역성화학 커버슬립을 제거한 후, 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 슬라이드를 새 1x PBS로 부드럽게 옮김. 1x PBS를 제거하고 실온에서 비이온 계면활성제(1x TBSt)의 0.1%로 1x Tris 완충 식염수에서 슬라이드의 35분 배양을 수행합니다. 적절한 크기의 용기에 탈이온수에서 희석된과산화수소(H2O2)의 250 mL를 준비합니다. 슬라이드를 실온에서 3% H2O2 용액으로 15분 동안 배양합니다. 참고: 과산화수소는 부식성이며 기관 규정에 따라 적절히 폐기해야 합니다. 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험실 코트 및 안전 안경)를 항상 사용해야 합니다. 탈이온수로 슬라이드를 빠르게 헹구십시오. 1x TBSt에서 슬라이드의 3 개의 5 분 세스를 수행하십시오. 필요한 경우 섹션에 액체를 유지하기 위해 장벽 펜이나 왁스 연필로 조직 부분을 윤곽. 즉시 사용 가능한 2.5% 혈청 차단 용액을 이차 항체 라벨링 키트와 함께 적용합니다(재료 표참조) 각 섹션에 드롭와이즈로. 20 분 동안 실온에서 습한 챔버에서 슬라이드를 인큐베이션. 희석항체(토끼 표지 덱스트란, 1:7,500; 물질표참조)에서 희석된 1차 항체를 준비하고 부드러운 파이펫팅으로 혼합한다. 슬라이드를 부드럽게 팁하여 블록 버퍼를 빼내고, 섹션 주변을 건조시키고, 슬라이드를 습한 챔버에 평평하게 놓습니다. 1차 항체 용액을 도용하기 전에 씻지 마십시오. 피펫 200 μL의 1차 항체 용액을 섹션상에 슬라이드 상에 상하여 밤새 4°C에서 습한 챔버에서 배양한다. 이차 전용 제어를 위해, 적절한 섹션 상에 희석된 항체의 파이펫 200 μL. 슬라이드를 부드럽게 팁하여 1차 항체 용액을 배출하고 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 1x TBSt에 넣습니다. 1x TBSt에서 슬라이드의 두 5 분 세차 작업을 수행합니다. 즉시 사용 가능한 백그라운드 감소 차단 시약을 적용합니다(재료 표참조) 각 섹션에 드롭와이즈로 적용합니다. 20 분 동안 실온에서 습한 챔버에서 슬라이드를 인큐베이션. 슬라이드를 부드럽게 팁하여 블록 버퍼를 빼내고, 조심스럽게 섹션 주변을 건조시키고, 슬라이드를 습한 챔버에 평평하게 놓습니다. 이차 항체 용액을 도용하기 전에 씻지 마십시오. 즉시 사용 가능한 이차 항체 용액 (항 토끼 고추 냉이 과산화 페록시다아제 (HRP) 폴리머 이차 항체를 각 섹션에 적하시키고 실온에서 습한 챔버에서 30 분 동안 배양하십시오. 슬라이드를 부드럽게 팁하여 이차 항체 용액을 빼내고 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 1x TBSt에 넣습니다. 1x TBSt에서 슬라이드의 2개의 5분 세차서를 수행합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하기 직전에 HRP 염색체 기판을 준비하십시오(재료 표참조). 섹션 주위의 영역을 건조하고, 슬라이드를 평평한 표면에 놓고, 각 섹션에 HRP 발색 기판의 200 μL을 적용합니다. 실온에서 3분 동안 인큐베이션하고, 기판이 제1 슬라이드에 적용될때 타이머를 시작한다(도 4). 기판 용액을 빼내고 1x PBS가 들어있는 코플린 항아리에서 슬라이드를 간략하게 헹구십시오. 슬라이드를 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 탈이온수에 넣고 부드러운 교반으로 탈이온 수에서 5분 간 2회 세서를 수행합니다. 최대 30s의 헤마톡실린 염색 용액에 넣어 슬라이드를 역염색하십시오.참고: 헤마톡실린은 독성이 있으며 기관 규정에 따라 폐기되어야 합니다. 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험실 코트 및 안전 안경)를 항상 사용해야 합니다. 슬라이드를 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 탈이온수에 넣고 탈이온수에서 3개의 5분 간 세차서를 수행합니다. 슬라이드를 Scott의 수돗물이 들어 있는 용기로 옮기고(재료 표참조) 1분 동안 배양합니다. 슬라이드를 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 탈이온수에 넣고 탈이온수에서 3개의 5분 간 세차서를 수행합니다. 일련의 에탄올(EtOH) 등급(탈이온수에서 희석)과 자일렌을 화학 적 후드에 통해 슬라이드를 탈수합니다. 70% EtOH에서 2분 인큐베이션, 95% EtOH에서 2개의 1분 인큐베이션, 100% EtOH에서 2개의 1분 인큐베이션, 자일렌에서 3개의 1분 인큐베이션을 수행합니다. 자일렌에서 슬라이드를 제거하고 화학 후드에 톨루엔 기반 장착 매체로 젖은 상태에서 커버 슬립을 놓습니다.참고: 자일렌과 톨루엔은 독성이 있고 인화성이 있으며 기관 규정에 따라 적절히 폐기해야 합니다. 자일렌과 톨루엔은 화학 후드에서 수행해야하며 적절한 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 코트 및 안전 안경)를 항상 사용해야합니다. IHC에 이어 100배 배율(10배 안구 배율 및 10배 객관적 배율)으로 복합 광 현미경 및 디지털 카메라로 슬라이드를 시각화하고 이미지화합니다. (그림5).