침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

모든 실험은 네덜란드 왕립 예술 과학 아카데미의 동물 복지 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 이 원고에 사용된 실험 프로토콜은 중앙 공소사 Dierproeven (CCD)와 인스턴트 보어 디렌웰지엔 (IvD)에 의해 승인되었다. 1. 종양 세포 이식 및 두개골 화상 진찰 창 준비 외과 준비 어떤 균주 또는 성별의 성인 마우스 (>6 주)를 사용하십시오. (플루아니손 [신경이완제]+ 펜타닐 [오피오이드]) (0.4 mL/kg) + 벤조디아제핀 진정제(2 mg/kg)를 멸균수에서 1:1:2의 용량으로 주입하여 마우스를 진정시. 발가락 핀치로 동물의 진정 상태를 평가합니다.참고: 본 프로토콜에서, 암컷 및 남성 C57BL/6 마우스는 이들 실험에 사용된 종양 세포주의 동일한 유전적 배경(GL261)으로 인해 사용되었다. 마우스는 완전히 진정 유지 됩니다 1.5 시간. 대안으로, 이소플루란 등 흡입 마 취 를 사용 하 여 (1.5%-2% 이소플루란/O2 혼합물). 마우스를 입체 프레임에 장착하고 노즈 클램프와 두 개의 이어 바를 사용하여 머리를 고정합니다. 체온을 보존하기 위해 가열 램프를 사용합니다. 가열 램프는 주의해서 사용되어야하며, 또는 물 재순환 가열 패드를 사용할 수 있습니다. 눈 연고를 적용하여 마우스의 각막이 건조되지 않도록 하십시오. 날카로운 가위를 사용하여 두개골의 털을 면도하고 (마우스의 눈에서 두개골 의 기저부까지 등쪽 영역)을 면도하고 노출된 피부를 70 % 에탄올로 소독하십시오. 날카로운 가위로 피부를 원형으로 자르고 면봉으로 아래 골막을 긁어냅니다. 리도카인 1% + 에피네프린 1:100,000을 5분 동안 바르고 면봉으로 과량분을 제거합니다. 치아노아크릴레이트 접착제로 피부 가장자리를 두개골에 붙입니다. 4배 배율의 해골 스테레오 현미경 아래에 입체 프레임을 놓습니다. 해부 현미경을 통해 두개골을 시각화하고 오른쪽 정수리 뼈 위에 직경 5mm의 원형 홈을 드릴. 두개골에 대한 압력을 피하면서 이 단계를 신중하고 피상적으로만 수행하십시오. 피질 완충액 (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM 포도당, 10 mM HEPES 버퍼, 2 mM MgSO4및 2 mM CaCl2 [pH 7.4])를 한 방울을 적용하고 얇은 집게를 사용하여 뼈 플랩을 들어 올립니다. 다음 단계의 경우, 달리 명시되지 않는 한 뇌 표면을 피질 버퍼로 덮습니다. 해부 현미경의 밑에, 두뇌 표면을 구상하고 곡면, 테이퍼, 아주 미세한 점 핀셋을 사용하여 dura mater를 제거합니다. 이 단계에서 출혈이 발생하면 흡수성 젤라틴 스폰지를 사용하여 출혈을 멈추십시오. 종양 세포 주입 PBS의 ~3 μL에서 원하는 형광 종양 세포의 양을 재중단하였다(예를 들어, 본 프로토콜에 도시된 실험에 대해, 1 x 105 GL261 세포를 주입하였다).참고: 어떤 형광 마커든지 사용될 수 있는 동안, 핵 마커는 분석 도중 개별 적인 종양 세포를 추적하기 위하여 강하게 조언됩니다. 추가적으로, H2B와 같은 히스톤 연결형광마커는, 염색체 응축을 구상하고, 그러므로, 세포 분열을 감시하기 위하여 이용될 수 있습니다. Dendra2와 같은 사진 전환 마커를 사용하면 며칠동안종양 세포의 사진 표시 및 추적이 가능합니다 4,13. 포인트 스타일 2 바늘로 10 μL 가스 꽉 주사기에 종양 세포를로드하고 스테레오 택시 조작기 팔에 고정. 피질 버퍼를 제거합니다. 주사기의 끝을 개두술 중간에 놓고 두개골 표면에서 0.5 mm 깊이로 삽입하십시오. 선택적으로, 종양 세포 현탁액을 수용하기 위해 뇌에 작은 공간을 생성한다. 이를 위해 주사기를 최대 1mm 깊이까지 삽입한 다음 주입 전에 최대 0.5mm까지 회수합니다. 피질 버퍼 한 방울을 적용합니다. 마이크로 시링기 펌프 인젝터 (250-400 nL / min)를 사용하여 셀 현탁액을 천천히 주입하십시오. 주사기를 제거하고 흡수성 젤라틴 스폰지를 사용하여 필요한 경우 출혈을 막습니다. 두개골 이미징 창 준비 피질 버퍼를 제거하고 창 아래기 기포를 피하기 위해 개두량 부위에 실리콘 오일 한 방울을 놓습니다. 노출된 뇌를 6mm 커버슬립으로 밀봉합니다. 커버 슬립과 두개골 사이에 시아노아크릴레이트 접착제를 바하십시오. 미세 핀셋의 도움으로 두개골에 덮개슬립을 부드럽게 눌러 뇌와 커버슬립 사이의 거리를 최소화합니다. 커버 슬립의 가장자리를 덮고, 두개골의 표면에 치과 아크릴 시멘트를 적용합니다. 얇은 스테인레스 스틸 링 (외부 직경 1.5 mm, 내경 1mm)을 개두량 주위에 놓고 치과 시멘트가 건조되도록하십시오. 선택적으로, 머리의 상단에 링을 고정하기 위해 테두리에 약간의 접착제를 추가합니다.참고 : 이 헤드 고정 시스템은 반전 된 현미경의 이미징에 최적입니다 : 이미징 상자에 내장 된 작은 자석은 두개골 이미징 창 (CIW) 고정을 용이하게합니다. 이 프로토콜에 표시된 실험에서, 반전된 현미경이 사용되었다. 직립 현미경의 경우 나사 또는 링에 맞는 플레이트를 사용하여 현미경에 부착 할 수있는 홈이있는 막대 또는 링을 사용하여 고정을 달성 할 수 있습니다. 통증 관리를 위해, 피하 적으로 100 μg / kg buprenorphine의 단일 복용량을 주입하고 동물이 가열 패드에서 회복 할 수 있도록. 농축을 위해 잘게 썬 종이가 있는 개별 케이지에 마우스를 놓습니다. 매일 처음 며칠 동안, 그리고 일주일에 2회씩 마우스를 면밀히 모니터링하여 정상적인 행동, 반응성 및 외모를 관찰합니다. 2. 인트라바이탈 이미징 참고: 종양 세포 주입과 첫 번째 분과 내 영상 세션 사이의 시간 간격은 사용되는 종양 세포주의 유형에 따라 달라집니다. 이 프로토콜에 표시된 실험의 경우, 1x 105 GL261 세포를 10일 후에 주입하고 이미지화하였다. 이미징 준비 얼굴 마스크 (1.5 %-2 % 이소플루란 / O2 혼합물)를 통해 이소플루란 흡입 마취를 사용하여 마우스를 진정시다. 탈수를 방지하기 위해 식염수 완충제 100 μL로 마우스를 피하로 주입하십시오.참고: 장기 이미징의 경우 피하 주입 펌프를 통해 마우스를 수화할 수 있습니다. 이미징 상자에 마우스를 얼굴을 위로 향하게 놓습니다. 조리개 주위에 1mm 직경의 구멍과 작은 자석이 박힌 금속 판을 사용하여 이미징 박스에 CIW를 고정시됩니다. 이소플루란을 안면 마스크를 통해 소개하고 상자 의 반대편에 있는 콘센트(0.8%-1.5% 이소플루란/O2 혼합물)로 환기시보세요. 선택적으로 테이프를 사용하여 마우스 본문을 고정합니다.참고: 혈관 시각화 또는 기타 염료를 위해 형광성으로 표지된 덱스트렌은 이 시점에서 정맥 주사될 수 있습니다. 선택적으로 펄스 산소 측정기와 가열 프로브를 사용하여 마우스의 활력을 모니터링하십시오.참고: 본 실험에서는 마우스가 이미징 기간(2-3시간)에 걸쳐 안정되었기 때문에 펄스 산소 측정기와 가열 프로브를 사용할 필요가 없었습니다. 그러나 이미징 시간이 길어지면 보다 철저한 모니터링이 필요할 수 있습니다. 25x(예: HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5mm)의 물 목표를 가장 낮은 z-위치로 설정하고 큰 물 방울을 추가합니다.참고: 과학자들이 실험 중에 물을 추가할 수 있기 때문에 수분 침지 마이크로 디스펜서를 사용하는 것이 장기적인 실험에 매우 권장됩니다. 또는, 건조 한 목표를 사용할 수 있습니다. 37°C에 보관된 어두운 기후 챔버가 장착된 현미경으로 이미징 박스를 옮김을 옮김. 물방울이 닿을 때까지 목표를 CIW 커버슬립에 넣습니다. 에피인광 모드를 사용하여 접안 렌즈를 통해 종양을 관찰하고 세포를 초점으로 가져옵니다. 타임랩스 이미지 수집 이미지에 관심 있는 여러 위치를 선택하고 소프트웨어에 좌표를 기록합니다. 선택된 위치가 종양의 다른 부위의 대표적인 위치인지 확인합니다(각 종양은 다를 수 있지만 일관성을 보장하기 위해 종양 코어의 중심인 동일한 양의 위치와 모든 마우스의 가장자리에 대해 선택하십시오).참고 : 종양 또는 전체 가시 종양의 일부의 타일 스캔이 수행 될 수있다; 그러나 종양이 크면이 방법은 이미지 사이의 시간 경과를 증가시게됩니다. 또한, 종양 세포가 빠르게 움직이면, 시간이 지남에 따라 동일한 세포를 추적하는 것이 어려울 수 있다. 다광자 모드로 전환하고 레이저를 올바른 파장에 맞춰 조정합니다. 광손상을 피하기 위해 더 높은 파장이 필요합니다.참고: Dendra2 이미징의 경우 960 nm 파장이 사용되었습니다. 이러한 실험에서 사용된 객관적으로, 1.3의 줌은 종양 핵의 양호한 분해능을 얻고 종양의 대표적인 영역을 스캔하기에 충분하였다. 라이브 모드로 이동하여 종양 세포 분해를 손상시키지 않고 종양 세포의 최대 부피를 획득하기 위해 각 위치에 대한 z-stack을 정의한다. 이미지 사이의 단계 크기를 3 μm로 정의합니다. 양방향 모드를 사용하여 스캔 속도를 높입니다. 이미지 해상도는 512 x 512 픽셀 이상이어야 합니다. 2시간 동안 20분마다 다른 위치에서 종양 볼륨의 이미지를 획득합니다. 각 이미지 획득 전에 목표에 물을 추가합니다.참고: 소프트웨어에서 적절한 시간 경과를 설정하여 타임랩스 이미지를 자동으로 획득할 수 있습니다. 그러나 마우스가 이동할 수 있으며 위치 또는 z-stack이 시간이 지남에 따라 이동하여 데이터 손실을 초래할 수 있습니다. 따라서 시간 경과를 수동으로 수행하고 획득 간에 xyz 시프트가 있는지 확인하고 조정하는 것이 좋습니다. 이 단계에서는 선택적으로 Dendra2 형광 마커를 사진 으로 전환합니다.참고 : 시간 경과 이미징 (개별 종양 세포 특성을 연구하고 시간이 지남에 따라 어떻게 변화하는지 연구 할 수 있음)과는 달리, 이것은 며칠 동안 뇌의 종양 세포 침투 영역을 연구 할 수 있습니다4. 이 단계에 대한 자세한 설명은 글리고리예비치 외13에의해 설명된다. 마지막 이미지를 획득한 후 스테이지에서 마우스를 제거하고 가열 패드에서 복구할 수 있습니다. 탈수를 방지하기 위해 식염수 100 μL을 피하로 투여 할 수 있습니다. 생검 같은 상해가 수행될 때까지 마우스를 케이지에 놓습니다. 3. 생검 같은 상해 및 CIW 보충 첫 번째 이미징 세션 후 1 일 종양 부위에서 생검과 같은 부상을 만듭니다.참고 : 또는 부분 종양 제거와 같은 다른 절차를 수행 할 수 있습니다. 앞서 단계 2.1.1에 설명된 바와 같이 이소플루란 흡입 마취를 사용하여 마우스를 분리한다.참고 : 주사용 마취를 사용할 수 있지만,이 절차는 CIW 이식보다 짧고, 흡입 마취는 정확하게 제어하고 마우스가 진정 남아있는 시간을 줄일 수 있습니다. 마우스를 스테레오택 프레임에 놓고 두 개의 이어 바와 노즈 클램프로 머리를 고정합니다. 페달 반사 의 부족에 의해 마취의 깊이를 확인합니다. 수술 중에 마우스를 진정시키기 위해 스테레오택시 수술을 위해 마취 마스크를 사용하십시오. 면봉을 아세톤에 담그고 커버슬립 가장자리에 펴서 뇌에 덮개가 있는 접착제를 부드럽게 합니다. 커버슬립 아래에 얇은 점집을 밀어 들어 올립니다. 이 시점에서 커버슬립이 파손되면 포셉을 사용하여 유리 조각을 제거합니다. 피질 버퍼를 적용하여 뇌를 촉촉하게 유지하십시오. 종양에 25G 바늘을 1mm 깊이로 담그십시오.참고 : 이 단계는 형광 입체 현미경으로 종양 영역을 보다 정확하게 식별 할 수 있습니다 (종양이 너무 작은 경우). 부가적으로, 형광 폴리스티렌 1 μm 비드의 1 μL 용액은 생검 영역을 확인하기 위해 펑크 동안 주입될 수 있다. 실리콘 오일로 뇌 표면을 밀봉하고 상단에 6mm 커버 슬립을 붙입니다. 4. 반복된 화상 진찰 생검 같이 상해를 입히고 (그리고 필요한 경우에 연속된 일에) 1 일 후에, 종양 세포 행동이 시간이 지남에 따라 어떻게 변경되는지 평가하기 위하여 위의 단계 2에서 기술한 대로 활력 내 화상 진찰을 반복하십시오. 전체 종양 영역을 대표할 종양의 여러 위치를 선택합니다.참고: 형광 비드가 생검 부위를 확인하기 위해 사용된 경우, 비생검 부위에 비해 생검 부위에서 종양 세포 행동을 이미지화합니다. 5. 이미지 분석 시간 경과 이미지를 수동으로 획득한 경우 하나의 폴더로 결합합니다. 현미경과 관련된 상용 소프트웨어에서 타임랩스 LIF 파일을 엽니다(예를 들어, LasX 또는 LAS AF). 탭 프로세스 > 프로세스 도구 > 병합을선택합니다. 시간 시퀀스의 첫 번째 이미지를 선택하고 첫 번째를 클릭합니다. 시간 시퀀스의 두 번째 이미지를 선택하고 두 번째를 클릭합니다. 차원병합에서 시간 t를 선택합니다. 적용을클릭합니다. 두 개의 타임포인트가 있는 새 파일이 생성됩니다. 새로 생성된 파일을 시퀀스의 첫 번째 이미지로 사용하여 모든 타임포인트에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 모든 xyz 시프트에 대해 획득한 z-스택을 수정합니다. 참고: 이 프로토콜에 설명된 실험의 경우 사용자 지정 디자인Visual Basic 소프트웨어 프로그램이 수정에 사용되었습니다. 또는 ImageJ 또는 Imaris와 같은 다른 사용 가능한 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 병합된 타임랩스 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 소프트웨어에서 TIFF 파일을 내보냅니다. RAW 데이터저장을 선택합니다. 내보낸 파일은 채널, 시간 및 z-position에 따라 명명된 하나의 폴더로 내보내집니다. 사용자 지정 설계된 Visual Basic 소프트웨어 프로그램에서 TIFF 파일을 엽니다. 타임포인트, z-스택 및 채널 수를 정의합니다. 모양 순서에 따라 각 채널에 색상을 지정합니다. 양식 표시 패널에서 각 타임포인트에 대해 위(U) 또는 아래(D) 버튼을 클릭하여 z의 이동을 수정합니다. Intravital 이미지 빌드 패널에서 xy 시프트에 대해 수정할 채널을 선택합니다. 종양 세포의 신호에 따라 수정할 녹색 채널을 선택합니다. xy 보정을 위해 자동을 클릭합니다. 수정된 이미지를 3개의 연속 z-스택의 최대 프로젝션으로 내보냅니다. 패널 선택에서내보낼 첫 번째(시작)와 마지막(끝) z-slices의 숫자를 소개합니다. 최대 . Z 에 대한 별도의 폴더를선택합니다. 수행을클릭합니다. 각각에 대해 3개의 z-stack, 시간 경과 이미지가 별도의 폴더로 내보내집니다. 선택적으로, 조직 탄성 변형에 대한 올바른.참고: 조직 탄성 변형 실험의 경우, 일치 운동 보상 소프트웨어 프로그램은 단단하고 탄성 조직 변형을 교정하기 위해 사용되었다14. 타임랩스 동영상에서 전체 z-스택에서 단일 셀을 추적합니다.참고: 종양 세포는 예를 들어 ImageJ 플러그인(MTrackJ)을 사용하여 수동으로 추적할 수 있습니다. 정확하지만 xy 평면으로 제한되며 시간이 많이 걸립니다. 대안적으로, 종양 세포는 종양 세포 분절(예를 들어, Imaris 소프트웨어)을 사용하여 전체 z-volume 을 통해 자동으로 추적될 수 있다. 그러나 고밀도 종양에서는 자동화된 추적이 덜 정확하며 더 많은 추적 오류를 초래할 수 있습니다. 각 타임랩스 시리즈(연속 3회 z-스택)를 별도로 열고 추적합니다. 시간 경과 이미지가 포함된 폴더를 ImageJ로 끕습니다. 탭 플러그인을 선택 > 추적 > MtrackJ. 각 시간대의 셀 추가 및 클릭을 선택하여 각 개별 셀을 추적합니다. 측정값을 클릭하고 파일을 저장하여 트랙의 측정값을 추출합니다.