Longitudinale Intravital beeldvorming van hersen tumor Celgedrag in reactie op een invasieve chirurgische biopsie

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het dierenwelzijns Comité van de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen, Nederland. De experimentele protocollen die in dit manuscript worden gebruikt, zijn goedgekeurd door de Centrale Commissie dierproeven (CCD) en het instantie voor dierenwelzijn (IvD). 1. tumor Cell implantatie en craniale Imaging Window voorbereiding Chirurgische voorbereiding Gebruik volwassen muizen (> 6 weken oud) van elke stam of geslacht. Sedate een muis door te injecteren (fluanisone [neuroleptic] + fentanyl [Opioid]) (0,4 mL/kg) + benzodiazepine kalmerend (2 mg/kg) in een dosis van 1:1:2 in steriel water. Beoordeel de sedatie toestand van het dier met teen pinch.Opmerking: in dit protocol werden zowel vrouwelijke als mannelijke C57BL/6 muizen gebruikt als gevolg van dezelfde genetische achtergrond van de tumor cellijn gebruikt in deze experimenten (GL261). De muis blijft volledig verdoofd voor 1,5 h. alternatief, gebruik inhalatie anesthesie zoals Isofluraan (1.5% – 2% Isofluraan/O2 mengsel). Monteer de muis op een Stereotactisch frame en bevestig het hoofd met behulp van een neusklem en twee gehoor stangen. Gebruik een verwarmings lamp om de lichaamstemperatuur te behouden. Verwarmings lamp moet met voorzichtigheid worden gebruikt, als alternatief kunnen ook water Recirculerende verwarmings pads worden gebruikt. Breng oogzalf aan om het hoornvlies van de muis te beschermen tegen drogen. Gebruik een scherpe schaar om de vacht op de schedel te scheren (ruggedeelte van de ogen van de muis naar de basis van de schedel) en Desinfecteer de blootgestelde huid met 70% ethanol. Snijd de huid op een cirkelvormige manier met een scherpe schaar en schrael het periosteum eronder met een wattenstaafje. Breng een druppel lidocaïne 1% + adrenaline 1:100000 voor 5 min, en verwijder de overmaat met een wattenstaafje. Lijm de randen van de huid aan de schedel met Cyanoacrylaat lijm. Plaats het stereotactische frame onder een dissectie stereomicroscoop met 4x vergroting. Visualiseer de schedel door de dissectie-Microscoop en boor een cirkelvormige groef van 5 mm in diameter over het rechter pariëtale bot. Voer deze stap zorgvuldig en alleen oppervlakkig uit, Vermijd elke druk op de schedel. Breng een druppel cortex-buffer aan (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES-buffer, 2 mM MgSO4en 2 mm CACL2 [pH 7,4]) en til de botflap met dunne Tang. Voor de volgende stappen, houd het hersen oppervlak bedekt met cortex buffer tenzij anders aangegeven. Visualiseer het hersen oppervlak onder de dissectie-Microscoop en verwijder de dura mater met gebogen, taps toelopende, zeer fijne punt pincet. Als er een bloeding optreedt in dit stadium, gebruik dan een absorbabele gelatine spons om het te stoppen. Tumor celinjectie Respendeer de gewenste hoeveelheid fluorescerende tumorcellen in ~ 3 μL PBS (bijv. voor de in dit protocol getoonde experimenten werden 1 x 105 GL261 cellen geïnjecteerd).Opmerking: Hoewel een fluorescerende marker kan worden gebruikt, wordt een nucleaire marker sterk aangeraden om individuele tumorcellen bij te houden tijdens de analyse. Daarnaast kan een met Histon verbonden fluorescerende marker, zoals H2B, worden gebruikt om chromosoom condensatie te visualiseren en zo de celdeling te bewaken. Het gebruik van een foto-schakelbaar marker, zoals Dendra2, maakt het mogelijk de foto-markering en het volgen van tumorcellen over meerdere dagen4,13. Laad de tumorcellen in een 10 μL gasdichte spuit met een punt stijl 2 naald en bevestig deze op de stereotaxic manipulator arm. Verwijder de cortex-buffer. Plaats de punt van de spuit in het midden van de craniotomie en steek deze op een diepte van 0,5 mm van het oppervlak van de schedel. Optioneel, maak een kleine ruimte in de hersenen om tegemoet te komen aan de tumor celsuspensie. Plaats hiervoor de spuit tot een diepte van 1 mm en haal deze vervolgens tot 0,5 mm voor de injectie. Breng een druppel cortex-buffer aan. Injecteer de celsuspensie langzaam met een micro spuitpomp injector (250 – 400 nL/min). Verwijder de spuit en gebruik een absorbabele gelatine spons om eventuele bloedingen te stoppen, indien nodig. Voorbereiding van het craniale beeldscherm Verwijder de cortex-buffer en plaats een druppel siliconenolie op de craniotomie-plaats om luchtbellen onder het raam te voorkomen. Seal de blootgestelde hersenen met een 6 mm coverslip. Breng Cyanoacrylaat lijm aan tussen de dekslip en de schedel. Druk zachtjes op de Afdeklijst tegen de schedel met behulp van fijne pincet om een minimale afstand tussen de hersenen en de dekslip te garanderen. Breng tandheelkundige acryl cement op het oppervlak van de schedel, bedekt de rand van de dekslip. Plaats een dunne roestvrijstalen ring (1,5 mm in buitendiameter, 1 mm in binnendiameter) rond de craniotomie en laat het tand cement drogen. Voeg desgewenst wat lijm aan de rand toe om de ring op de bovenkant van het hoofd vast te zetten.Opmerking: dit hoofd fixatiesysteem is optimaal voorbeeld vorming op een omgekeerde Microscoop: kleine magneten ingebed in de Imaging Box vergemakkelijken de craniale Imaging Window (CIW) fixatie. In de experimenten die in dit protocol worden getoond, werd een omgekeerde Microscoop gebruikt. Voor rechtopstaande microscopen kan fixatie worden bereikt door middel van een staaf of een ring met groeven die aan de Microscoop kunnen worden bevestigd met behulp van schroeven of een plaat die bij de ring past. Voor pijnbestrijding, Injecteer een enkelvoudige dosis van 100 μg/kg buprenorfine subcutaan en laat het dier te herstellen op een verwarmingskussen. Plaats de muis in een individuele kooi met versnipperd papier voor verrijking. Bewaak de muis dagelijks gedurende de eerste paar dagen en 2x per week, daarna, voor normaal gedrag, reactiviteit en uiterlijk. 2. intravital beeldvorming Opmerking: het tijdsinterval tussen de tumor celinjectie en de eerste intravital Imaging sessie is afhankelijk van het type tumor cellijn gebruikt. Voor de experimenten die in dit protocol worden getoond, werden 1x 105 GL261 cellen geïnjecteerd en 10 dagen later afbeelding gemaakt. Voorbereiding van Imaging Sedate de muis met behulp van Isofluraan inhalatie anesthesie door middel van een gezichtsmasker (1.5% – 2% Isofluraan/O2 mengsel). Injecteer de muis subcutaan met 100 μL zout buffer om uitdroging te voorkomen.Opmerking: voor langdurige beeldvorming kan de muis worden gehydrateerd door middel van een subcutane infusiepomp. Plaats de muis face-up in een Imaging box. Gebruik een metalen plaat met een gat met 1 mm diameter en kleine magneten rond het diafragma om de CIW te fixeren op de beeldvormings doos. Introduceer Isofluraan via een gelaatsmasker en ventileren door een uitlaat aan de andere kant van de doos (0,8% – 1,5% Isofluraan/O2 mengsel). Gebruik desgewenst tape om de hoofdtekst van de muis vast te stellen.Opmerking: op dit punt kan het fluorescently gelabeld dextran voor bloedvat visualisatie of andere kleurstoffen intraveneus worden geïnjecteerd. Gebruik desgewenst een Pulse Oximeter en een verwarmings sonde om de Vitals van de muis te bewaken.Opmerking: in dit experiment was het niet nodig om een Pulse Oximeter en een verwarmings sonde te gebruiken, omdat de muis gedurende de beeldvormings periode stabiel was (2 – 3 uur). Voor langere beeldvormings tijden kan echter een grondige controle nodig zijn. Stel de water doelstelling 25x (bijv. HCX IRAPO NA 0,95 WD 2,5 mm) in op de laagste z-positie en voeg een grote druppel water toe.Opmerking: het gebruik van een water onderdompeling micro dispenser wordt sterk aangeraden voor lange termijn experimenten, omdat het wetenschappers in staat stelt om water toe te voegen tijdens het experiment. U ook een droge doelstelling gebruiken. Breng de beeldvormings doos over op de Microscoop die is uitgerust met een donkere klimaatkamer die op 37 °C wordt gehouden. Breng de doelstelling naar de CIW afdek tot de waterdruppel raakt. Observeer de tumor via het oculair met behulp van de epifluorescentie-modus en breng de cellen scherp. Time-lapse-beeld verwerving Selecteer verschillende posities van belang voor de afbeelding en noteer hun coördinaten in de software. Zorg ervoor dat de geselecteerde posities representatieve posities zijn van verschillende plaatsen van de tumor (elke tumor kan verschillend zijn, maar om consistentie te garanderen, selecteert u dezelfde hoeveelheid posities die centraal staan in de tumor kern en aan de randen over alle muizen).Opmerking: een tegel scan van een deel van de tumor of van de hele zichtbare tumor kan worden uitgevoerd; echter, als de tumor is groot, deze methode zal de time-lapse tussen de beelden te verhogen. Bovendien, als de tumorcellen snel bewegen, het kan lastig zijn om te volgen dezelfde cellen in de tijd. Schakel over naar de multiphoton-modus en stem de laser af op de juiste golflengte. Merk op dat, om foto schade te voorkomen, hogere golflengten gewenst zijn.Opmerking: voor Dendra2 Imaging werd een golflengte van 960 nm gebruikt. Met het doel dat in deze experimenten wordt gebruikt, was een zoom van 1,3 voldoende om een goede oplossing van de tumor kernen te krijgen en een representatief gebied van de tumor te scannen. Ga naar de Live-modus en definieer een z-stack voor elke positie om het maximale volume van tumorcellen verwerven zonder afbreuk te doen aan de tumor celresolutie. Definieer de stapgrootte tussen de beelden als 3 μm. Gebruik de bidirectionele modus om de scansnelheid te verhogen. De afbeeldingsresolutie moet ten minste 512 x 512 pixels zijn. Verwerven van beelden van het tumor volume op verschillende posities elke 20 min voor 2 h. Voeg water toe aan de doelstelling vóór elke beeld verwerving.Opmerking: timelapse-beelden kunnen automatisch worden verkregen door de juiste timelapse in de software in te stellen. De muis kan echter bewegen en de positie of z-stack kan in de loop van de tijd verschuiven, waardoor gegevens verloren gaan. Daarom is het raadzaam om de timelapse handmatig uit te voeren en te controleren en aan te passen voor xyz verschuivingen tussen overnames. Bij deze stap, optioneel, Photo-switch de Dendra2 fluorescerende marker.Opmerking: in tegenstelling tot time-lapse Imaging (die het mogelijk maakt het bestuderen van individuele tumorcellen eigenschappen en hoe ze veranderen na verloop van tijd), dit zal toelaten het bestuderen van het gebied van tumor cel infiltratie in de hersenen over meerdere dagen4. Een gedetailleerde uitleg van deze stap wordt beschreven door Gligorijevic et al.13. Nadat de laatste afbeelding is verkregen, verwijdert u de muis uit het werkgebied en laat u deze op een verwarmingspaneel herstellen. Om uitdroging te voorkomen, kan 100 μL zoutoplossing subcutaan worden toegediend. Plaats de muis in de kooi totdat de biopsie-achtige verwonding wordt uitgevoerd. 3. biopsie-achtige letsel en CIW vervanging Maak een biopsie-achtige verwonding op de tumor site 1 dag na de eerste Imaging sessie.Opmerking: als alternatief kan een andere procedure, zoals gedeeltelijke tumor verwijdering, worden uitgevoerd. Sedate de muis met behulp van Isofluraan inhalatie anesthesie zoals eerder beschreven in stap 2.1.1.Opmerking: terwijl injecteerbare anesthesie kan worden gebruikt, deze procedure is korter dan de CIW implantatie, en inhalatie anesthesie maakt het mogelijk om nauwkeurig te controleren en te verminderen de tijd die de muis blijft verdoofd. Plaats de muis op een stereotaxic frame en bevestig de kop met twee gehoor stangen en een neusklem. Controleer de diepte van de anesthesie door het gebrek aan pedaal reflexen. Gebruik een verdoving masker voor stereotaxus chirurgie te houden van de muis verdoofd tijdens de procedure. Dompel een wattenstaafje in aceton en verdeel het rond de rand van de dekslip om de lijm te verzachten die de dekslip tegen de hersenen vasthoudt. Schuif de dunne punt Tang onder het dekglaasje om hem op te tillen. Als de dekslip op dit punt breekt, gebruik dan de tang om de stukjes glas te verwijderen. Breng cortex buffer om de hersenen vochtig te houden. Dompel een 25 G naald in de tumor tot een diepte van 1 mm. Verwijder de naald en stop het bloeden, indien nodig, door het aanbrengen van een gelatine steriele spons.Opmerking: deze stap kan worden uitgevoerd onder een fluorescerende stereomicroscoop om het tumor gebied nauwkeuriger te identificeren (als de tumor te klein is). Bovendien kan een 1 μL oplossing van fluorescerende polystyreen 1 μm kralen worden geïnjecteerd tijdens de punctie om het biopsied gebied te identificeren. Verzegel het hersen oppervlak met siliconenolie en lijm een 6 mm dekslip op de bovenkant. 4. herhaalde beeldvorming Een dag na het toebrengen van de biopsie-achtige letsel (en op opeenvolgende dagen indien nodig), herhaal intravital beeldvorming zoals beschreven in stap 2 hierboven om te beoordelen hoe het tumor Celgedrag verandert na verloop van tijd. Selecteer verschillende posities van de tumor die representatief zou zijn voor het hele tumor gebied.Opmerking: als fluorescerende kralen werden gebruikt om het biopsied gebied te identificeren, lokaliseer ze naar beeld tumor Celgedrag in de biopsied regio’s in vergelijking met niet-biopsied regio’s. 5. beeldanalyse Als de timelapse-afbeeldingen handmatig zijn verkregen, combineert u deze in één map. Open de time-lapse LIF-bestand in de commerciële software die is gekoppeld aan de Microscoop (bijvoorbeeld LasX of LAS AF). Selecteer het tabblad proces ≫ proces hulpmiddelen > samenvoegen. Selecteer de eerste afbeelding van de tijdreeks en klik op eerste. Selecteer de tweede afbeelding van de tijdreeks en klik op tweede. Selecteer bij samenvoegings dimensies t voor tijd. Klik op toepassen. Er wordt een nieuw bestand met twee tijdspunten gegenereerd. Herhaal dit proces voor alle tijdspunten, met behulp van het nieuw gegenereerde bestand als de eerste afbeelding van de reeks. Corrigeer de verworven z-stacks voor elke xyz -verschuiving.Opmerking: voor de experimenten die in dit protocol worden beschreven, is een speciaal ontworpen Visual Basic-softwareprogramma gebruikt voor correctie. U ook andere beschikbare software gebruiken, zoals ImageJ of Imaris. Exporteer de TIFF-bestanden van de software door met de rechtermuisknop op het samengevoegde time-lapse-bestand te klikken. Selecteer onbewerkte gegevens opslaan. De geëxporteerde bestanden worden geëxporteerd naar één map met de naam op basis van het kanaal, de tijd en de z-positie. Open de TIFF-bestanden in het speciaal ontworpen Visual Basic-softwareprogramma. Definieer het aantal tijdpunten, z-stacks en kanalen. Wijs een kleur toe aan elk kanaal door de volgorde van weergave. Corrigeer in het deelvenster formulier weergeven voor elk tijdpunt de verschuiving in de z door op de knoppen omhoog (U) of omlaag (D) te klikken. Selecteer in het deelvenster Intravital Image Building het kanaal dat moet worden gebruikt om de XY -verschuiving te corrigeren. Selecteer het groene kanaal om te corrigeren, op basis van het signaal van de tumorcellen. Klik op automatisch voor XY -correctie. Exporteer de gecorrigeerde afbeeldingen als een maximale projectie van drie opeenvolgende z-stacks. In de deelvenster selectieintroduceert u de nummers van de eerste (begin) en de laatste (eind) z-segmenten die u wilt exporteren. Selecteer Max. Selecteer afzonderlijke mappen voor Z. Klik op do. Voor elk van deze, drie z-stacks, time-lapse-beelden worden geëxporteerd naar een aparte map. Optioneel, correct voor de weefsel elastische vervorming.Opmerking: voor weefsel elastische vervorming experimenten, een match motion compensatie softwareprogramma werd gebruikt om te corrigeren voor stijve en elastische weefsel vervorming14. Volg enkele cellen in de volledige z-stack in de time-lapse-film.Opmerking: tumor cellen kunnen handmatig worden bijgehouden met bijvoorbeeld een ImageJ-plugin (MTrackJ). Hoewel nauwkeurig, dit is beperkt tot het XY -vlak en is zeer tijdrovend. Als alternatief, tumorcellen kunnen automatisch worden bijgehouden in het volledige z-volume, met behulp van tumor celsegmentatie (bv, imaris software). Echter, in zeer dichte tumoren, geautomatiseerde tracking is minder nauwkeurig en kan aanleiding geven tot meer tracking fouten. Open en volg elke time-lapse-serie (voor drie opeenvolgende z-stacks) afzonderlijk. Sleep de map met de timelapse-afbeeldingen naar ImageJ. Selecteer het tabblad Plugins > Tracking > mtrackj. Volg elke afzonderlijke cel door toevoegen te selecteren en te klikken op elke cel op elk tijdpunt. Pak de meting van de tracks uit door op meten te klikken en het bestand op te slaan.