Imaging intravitale longitudinale del comportamento delle cellule tumorali cerebrali in risposta a una biopsia chirurgica invasiva
Summary
Qui descriviamo un metodo per l’imaging multi-fotofilano ad alta risoluzione delle cellule tumorali cerebrali prima e dopo l’intervento chirurgico invasivo (ad esempio, biopsia) all’interno dello stesso animale vivente. Questo metodo consente di studiare l’impatto di queste procedure chirurgiche invasive sul comportamento migratorio, invasivo e proliferativo delle cellule tumorali a livello di singola cellula.
Abstract
Le biopsie sono standard di cura per il trattamento del cancro e sono clinicamente utili in quanto consentono la diagnosi di tumore solido, prognosi, e la determinazione del trattamento personalizzato. Tuttavia, la perturbazione dell’architettura tumorale mediante biopsia e altre procedure invasive è stata associata a effetti indesiderati sulla progressione del tumore, che devono essere studiati in profondità per migliorare ulteriormente il beneficio clinico di queste procedure. Gli approcci statici convenzionali, che forniscono solo un’istantanea del tumore, sono limitati nella loro capacità di rivelare l’impatto della biopsia sul comportamento delle cellule tumorali come la migrazione, un processo strettamente correlato alla malignità tumorale. In particolare, la migrazione delle cellule tumorali è la chiave nei tumori cerebrali altamente aggressivi, dove la diffusione del tumore locale rende praticamente impossibile la resezione totale del tumore. Lo sviluppo dell’imaging multifotonico e delle finestre di imaging cronico consente agli scienziati di studiare questo processo dinamico negli animali viventi nel tempo. Qui, descriviamo un metodo per l’imaging longitudinale ad alta risoluzione delle cellule tumorali cerebrali prima e dopo una biopsia nello stesso animale vivente. Questo approccio consente di studiare l’impatto di questa procedura sul comportamento delle cellule tumorali (migrazione, invasione e proliferazione). Inoltre, discutiamo i vantaggi e le limitazioni di questa tecnica, così come la capacità di questa metodologia di studiare i cambiamenti nel comportamento delle cellule tumorali per altri interventi chirurgici, tra cui la resezione tumorale o l’impianto di chemioterapia Wafer.
Introduction
Standard di cura per la maggior parte dei tumori solidi include biopsia tissutale per la diagnosi, prognosi, e la determinazione del trattamento personalizzato1,2. Nel complesso, queste procedure danno beneficio clinico, ma prove recenti indicano che la biopsia e altre procedure più invasive, come la resezione tumorale, possono anche influenzare negativamente la progressione del tumore3,4,5 , 6. Sebbene queste procedure rimangano indispensabili per l’assistenza all’in-paziente e i loro benefici ne superino gli effetti negativi, è necessario comprendere appieno i meccanismi alla base di questi effetti negativi al fine di massimizzare la sicurezza dei pazienti e la influenze positive di queste procedure e renderle ancora più clinicamente vantaggiose.
Gli effetti indesiderati mediati dalla biopsia sulla progressione del tumore sono innescati da alterazioni sistemiche e cambiamenti nel microambiente tumorale in risposta alla rottura dei tessuti4,5. Quindi, è necessario studiare questo processo negli animali vivi. Tuttavia, le conseguenze sottili di queste procedure minimamente invasive possono spesso essere mascherate da grandi variazioni tra gli individui. I metodi convenzionali basati sull’immunosofochimica o sull’analisi dell’espressione trascrizionale possono trascurare questi effetti o richiedere un gran numero di animali per identificarli. Inoltre, questi approcci statici non sono in grado di identificare i cambiamenti nel comportamento delle cellule tumorali come la migrazione e l’invasione, processi dinamici che correlano con la malignità tumorale. Queste caratteristiche delle cellule tumorali sono di particolare importanza per i tumori cerebrali altamente aggressivi, come il glioblastoma multiforme (GBM), dove la diffusione locale delle cellule tumorali limita la resezione chirurgica e diminuisce la sopravvivenza del paziente7. Per comprendere appieno in che modo le biopsie influenzano il comportamento delle cellule GBM, è necessario un approccio longitudinale che permetta la visualizzazione di queste cellule nel contesto fisiologico degli organismi viventi.
Il recente sviluppo dell’imaging intravitale ad alta risoluzione in combinazione con finestre di imaging cronico impiantate chirurgicamente consente agli scienziati di studiare il comportamento dinamico delle cellule tumorali nei topi viventi per più giorni8,9. Utilizzando questo potente approccio, possiamo studiare come il comportamento proliferativo, migratorio e infiltrativo delle cellule tumorali cambia nel corso di diversi giorni in risposta a una biopsia nello stesso topo. Rispetto ad altre tecniche che consentono il monitoraggio di più giorni dei tumori nei topi vivi, come la risonanza magnetica (RMI)10, la tomografia a emissione di positroni/tomografia computerizzata (PET/CT)11, o l’imaging bioluminescente12, questo approccio offre in modo unico la possibilità di studiare il comportamento delle cellule tumorali a livello di singola cellula e svelare sottili cambiamenti che si verificano all’interno del tumore.
Qui, descriviamo un metodo dettagliato per eseguire lesioni biopsia e imaging intravitale longitudinale pre e postbiopsia nel cervello dei topi portatori di tumore. Questo metodo può essere potenzialmente applicato per studiare altri interventi chirurgici, come la resezione parziale del tumore o l’impianto di wafer di chemioterapia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un metodo per studiare i cambiamenti nel comportamento delle cellule tumorali a livello di singola cellula in risposta a procedure chirurgiche invasive, come una biopsia, nel cervello di un animale vivente. La combinazione di imaging multifotolino longitudinale con l’impianto chirurgico di una CIW cronica consente la quantificazione della migrazione delle cellule tumorali, l’invasione e la proliferazione prima e dopo la biopsia nello stesso animale4. Rispetto ad altri approcci utilizzati per il monitoraggio multigiorno del tumore, come l’imaging bioluminescente12, la risonanza magnetica10, la PET/CT11,questo metodo visualizza in modo univoco i tumori a livello di singola cellula e, pertanto, fornisce informazioni sul comportamento cellulare progressione tumorale sottostante.
Per eseguire correttamente questo metodo, è necessario padroneggiare diverse procedure. I passaggi più critici di questo protocollo sono l’impianto e la sostituzione CIW. La complessità tecnica di questi passaggi richiede precisione e abilità chirurgiche che possono essere acquisite con una formazione costante. Complicazioni durante l’intervento chirurgico CIW, come sanguinamento che può coprire la superficie del cervello, può rivelarsi impegnativo per l’imaging successivo. Una mancanza di strumenti sterili o ambiente, così come l’incapacità di sigillare completamente la superficie del cervello, può causare un’infezione sulla superficie del cervello (liquido bianco sotto il coperchio), che renderà l’imaging problematico e fortemente compromettere il risultante interpretazione. Un altro problema comune di questo protocollo è il movimento degli animali durante l’imaging time-lapse. Mentre qualsiasi spostamento xyz può essere corretto dopo l’esperimento, si consiglia di correggere la coordinata di ogni posizione prima di ogni punto temporale per evitare qualsiasi perdita di informazioni. La deformazione dei tessuti è un problema aggiuntivo riscontrato durante l’imaging al microscopio invertito. Tessuto cerebrale soffre di compressione quando il mouse è posizionato in posizione supina. A seconda del grado di deformazione dei tessuti, il tracciamento delle cellule tumorali può portare a una quantificazione errata dello spostamento cellulare. Per evitare questo, un software per la deformazione rigida ed elastica può essere utilizzato14.
Mentre questa procedura offre un’ampia applicazione per studiare i cambiamenti nel comportamento del tumore, alcune limitazioni dovrebbero essere considerate. Questo metodo consente agli scienziati di immaginare fino a una profondità di 1,6 mm (con l’uso di un oscillatore parametrico ottico); tuttavia, ciò significa che l’imaging è limitato alle aree superficiali della corteccia cerebrale15. Così, alcuni tumori cerebrali situati in strutture cerebrali profonde, tra cui gliomi pontine intrinseci diffusi situati nella regione del tronco encefalico, non possono essere studiati nel loro ambiente cerebrale originale con questo protocollo. Un’altra limitazione di questo protocollo è il volume del tumore che può essere imageta. Anche se la scansione totale del volume del tumore si desidera ottenere informazioni massime, spesso, la dimensione del tumore e la velocità delle cellule migratorie possono essere fattori limitanti. Per ogni tipo di tumore, è necessario considerare un time-lapse ottimale per l’imaging. Se l’intervallo di tempo tra le immagini è troppo lungo, potrebbe essere difficile tenere traccia delle cellule tumorali. L’uso di uno scanner risonante può ridurre notevolmente il tempo di scansione, consentendo l’imaging di un tumore più grande16. Infine, l’analisi manuale delle immagini di questo protocollo può richiedere molto tempo, quindi invece, è possibile utilizzare programmi per il monitoraggio 3D automatizzato. Tuttavia, il risultato del monitoraggio deve sempre essere sottoposto a supervisione visiva poiché gli algoritmi per il tracciamento automatico delle celle sono raramente progettati per ricapitolare esattamente la migrazione delle celle di interesse.
Piccoli adattamenti del protocollo qui descritto possono consentire una gamma ancora più ampia di applicazioni. Invece di eseguire biopsie, possono essere implementati altri interventi (chirurgici), come la resezione tumorale parziale o la consegna di wafer di chemioterapia. L’aggiunta di composti attraverso un microtubo impiantato chirurgicamente può essere combinata con questo protocollo per colpire farmacologicamente specifiche molecole di interesse. Ci aspettiamo che questo modello sarà utile negli studi che mirano ad analizzare l’impatto di un certo intervento sul comportamento delle cellule tumorali. La possibilità di eseguire misure ripetute nello stesso animale non solo fornisce dati più precisi sui cambiamenti che si verificano nel tumore, ma riduce anche notevolmente il numero di animali sperimentali necessari per ogni studio.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Anko de Graaff e l’Hubrecht Imaging Center per il loro supporto per l’imaging e Ellen Wehrens e Hannah Johnson per la revisione e la modifica del manoscritto.
Materials
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
References
- Heuckmann, J. M., Thomas, R. K. A new generation of cancer genome diagnostics for routine clinical use: overcoming the roadblocks to personalized cancer medicine. Annals of Oncology. 26, 1830-1837 (2015).
- van Malenstein, H., et al. Histology obtained by needle biopsy gives additional information on the prognosis of hepatocellular carcinoma. Hepatology Research. 42, 990-998 (2012).
- Kretschmer, L., et al. High incidence of in-transit metastases after sentinel node biopsy in patients with melanoma (Br J Surg 2004; 91: 1370-1371). British Journal of Surgery. 92, 253-254 (2005).
- Alieva, M., et al. Preventing inflammation inhibits biopsy-mediated changes in tumor cell behavior. Scientific Reports. 7, 7529 (2017).
- Hobson, J., et al. Acute inflammation induced by the biopsy of mouse mammary tumors promotes the development of metastasis. Breast Cancer Research Treatment. 139, 391-401 (2013).
- Weil, S., et al. Tumor microtubes convey resistance to surgical lesions and chemotherapy in gliomas. Neuro-Oncology. 19, 1316-1326 (2017).
- Parsa, A. T., et al. Prognostic significance of intracranial dissemination of glioblastoma multiforme in adults. Journal of Neurosurgery. 102, 622-628 (2005).
- Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31, 602-606 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4, 158ra145 (2012).
- Schreurs, T. J., et al. Quantitative Multi-Parametric Magnetic Resonance Imaging of Tumor Response to Photodynamic Therapy. PLOS ONE. 11, e0165759 (2016).
- Nielsen, C. H., et al. PET imaging of tumor neovascularization in a transgenic mouse model with a novel 64Cu-DOTA-knottin peptide. 암 연구학. 70, 9022-9030 (2010).
- Alieva, M., et al. Glioblastoma therapy with cytotoxic mesenchymal stromal cells optimized by bioluminescence imaging of tumor and therapeutic cell response. PLOS ONE. 7, e35148 (2012).
- Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. Dendra2 photoswitching through the Mammary Imaging Window. Journal of Visualized Experiment. (28), e1278 (2009).
- Noordmans, H. J., Roode, R. d., Staring, M., Verdaasdonk, R. . Registration and analysis of in vivo multispectral images for correction of motion and comparison in time. , (2006).
- Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16, 106014 (2011).
- Kirkpatrick, N. D., et al. Video-rate resonant scanning multiphoton microscopy: An emerging technique for intravital imaging of the tumor microenvironment. IntraVital. 1, (2012).
