التصوير التحيئي الطولي لسلوك خلايا أورام الدماغ استجابة لخزعة جراحية غازية
Summary
هنا نقوم بوصف طريقة لتصوير متعدد الفوتونات عالية الدقة بفاصل زمني لخلايا أورام الدماغ قبل وبعد التدخل الجراحي الغازي (على سبيل المثال، خزعة) داخل نفس الحيوان الحي. تسمح هذه الطريقة بدراسة تأثير هذه الإجراءات الجراحية الغازية على سلوك الخلايا السرطانية المهاجرة والغازية والتكاثرية على مستوى خلية واحدة.
Abstract
الخزعات هي معيار الرعاية لعلاج السرطان ومفيدة سريريا لأنها تسمح تشخيص الورم الصلب، والتشخيص، وتحديد العلاج شخصية. ومع ذلك، فإن اضطراب بنية الورم عن طريق خزعة وغيرها من الإجراءات الغازية قد ارتبط بالآثار غير المرغوب فيها على تطور الورم، والتي تحتاج إلى دراسة متعمقة لزيادة تحسين الفائدة السريرية لهذه الإجراءات. النهج الثابتة التقليدية، التي توفر فقط لقطة من الورم، محدودة في قدرتها على الكشف عن تأثير خزعة على سلوك الخلايا السرطانية مثل الهجرة، وهي عملية ترتبط ارتباطا وثيقا الخبيثة الورم. على وجه الخصوص، هجرة الخلايا السرطانية هي المفتاح في أورام الدماغ العدوانية للغاية، حيث نشر الورم المحلي يجعل استئصال الورم الكلي من المستحيل تقريبا. تطوير التصوير متعدد الفوتونات ونوافذ التصوير المزمن يسمح للعلماء لدراسة هذه العملية الديناميكية في الحيوانات الحية مع مرور الوقت. هنا، نقوم بوصف طريقة للتصوير الطولي عالي الدقة لخلايا أورام الدماغ قبل وبعد خزعة في نفس الحيوان الحي. هذا النهج يجعل من الممكن لدراسة تأثير هذا الإجراء على سلوك الخلايا السرطانية (الهجرة والغزو والانتشار). وعلاوة على ذلك، نناقش مزايا وقيود هذه التقنية، فضلا عن قدرة هذه المنهجية على دراسة التغييرات في سلوك الخلايا السرطانية للتدخلات الجراحية الأخرى، بما في ذلك استئصال الورم أو زرع العلاج الكيميائي رقائق.
Introduction
معيار الرعاية لمعظم الأورام الصلبة يشمل خزعة الأنسجةللتشخيص، والتشخيص، وتحديد العلاج الشخصي 1،2. عموما، هذه الإجراءات تعطي فائدة سريرية، ولكن الأدلة الأخيرة تشير إلى أن خزعة وغيرها من الإجراءات أكثر الغازية، مثل استئصال الورم، يمكن أيضا أن تؤثر سلبا على تطور الورم3،4،5 , 6.في حين أن هذه الإجراءات لا تزال لا غنى عنها في الرعاية داخل والفوائد التي تتغلب على آثارها السلبية، فمن الضروري أن نفهم تماما الآليات الكامنة وراء هذه الآثار السلبية من أجل تحقيق أقصى قدر من سلامة المرضى و التأثيرات الإيجابية لهذه الإجراءات وجعلها أكثر فائدة سريريا.
يتم تشغيل الآثار غير المرغوب فيها بخزعة على تطور الورم عن طريق التعديلات النظامية والتغيرات في البيئة الدقيقة الورم استجابة لاضطراب الأنسجة4،5. وبالتالي، فمن الضروري لدراسة هذه العملية في الحيوانات الحية. ومع ذلك، فإن العواقب الخفية لهذه الإجراءات طفيفة التوغل يمكن في كثير من الأحيان أن تكون مقنعة من قبل اختلافات كبيرة بين الأفراد. الأساليب التقليدية القائمة على الكيمياء المناعية أو تحليل التعبير النسخي قد تغفل هذه الآثار أو تتطلب أعدادا كبيرة من الحيوانات للتعرف عليها. وعلاوة على ذلك، هذه النهج الثابتة تفتقر إلى القدرة على تحديد التغيرات في سلوك الخلايا السرطانية مثل الهجرة والغزو، والعمليات الحيوية التي ترتبط مع الورم الخبيث. هذه السمات الخلية الورم ية ذات أهمية خاصة لأورام الدماغ العدوانية للغاية، مثل الورم الأرومي الدبقي multiforme (GBM)، حيث الانتشار المحلي للخلايا السرطانية يحد من الاستئصال الجراحي ويقلل من بقاء المريض7. لفهم كامل كيف تؤثر الخزعات على سلوك خلايا GBM، هناك حاجة إلى نهج طولي يسمح بتصور هذه الخلايا في السياق الفسيولوجي للكائنات الحية.
التطور الأخير للتصوير داخل الحيوية عالية الدقة في تركيبة مع نوافذ التصوير المزمن المزروعة جراحيا يسمح للعلماء لدراسة السلوك الديناميكي للخلايا السرطانية في الفئران الحية على مدى أيام متعددة8،9. باستخدام هذا النهج القوي، يمكننا دراسة كيفية تغير السلوك التكاثري والهجرة والتسللي للخلايا السرطانية على مدى عدة أيام استجابة لخزعة في نفس الماوس. بالمقارنة مع التقنيات الأخرى التي تسمح برصد متعددة الأيام من الأورام في الفئران الحية، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)10، التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير المقطعي المحوسب (PET / CT)11، أو التصوير الإنارة الحيوية12، وهذا Approach يوفر بشكل فريد إمكانية دراسة سلوك الخلايا السرطانية على مستوى خلية واحدة وكشف التغيرات الدقيقة التي تحدث داخل الورم.
هنا، نقوم بوصف طريقة مفصلة لإجراء إصابة تشبه الخزعة والتصوير الطولي قبل وبعد الخزعة داخل الحيوية في الدماغ من الفئران الحاملة للورم. يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة التدخلات الجراحية الأخرى، مثل استئصال الورم الجزئي أو زرع رقاقات العلاج الكيميائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقوم بوصف طريقة لدراسة التغيرات في سلوك الخلايا السرطانية على مستوى خلية واحدة استجابة للإجراءات الجراحية الغازية، مثل خزعة، في دماغ الحيوان الحي. الجمع بين التصوير متعدد الفوتونات الطولية مع الزرع الجراحي لCIW المزمنة تمكن من التحديد الكمي لهجرة الخلايا السرطانية، والغزو، والانتشار قبل وبعد خزعة في نفس الحيوان4. بالمقارنة مع الطرق الأخرى المستخدمة لرصد الورم متعدد الأيام، مثل التصوير الإنارة الحيوية12، التصوير بالرنين المغناطيسي10، أو PET / CT11، تصور هذه الطريقة بشكل فريد الأورام على مستوى خلية واحدة ، وبالتالي ، يوفر نظرة ثاقبة في السلوك الخلوي تطور الورم الأساسي.
لتنفيذ هذا الأسلوب بنجاح، يجب إتقان العديد من الإجراءات. الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي زرع CIW واستبدالها. ويتطلب التعقيد التقني لهذه الخطوات الدقة والمهارات الجراحية التي يمكن اكتسابها من خلال التدريب المستمر. قد تكون المضاعفات أثناء جراحة CIW، مثل النزيف الذي قد يغطي سطح الدماغ، صعبة بالنسبة للتصوير اللاحق. عدم وجود أدوات معقمة أو بيئة، فضلا عن الفشل في ختم تماما سطح الدماغ، قد يسبب عدوى على سطح الدماغ (السائل الأبيض تحت غطاء)، مما سيجعل التصوير إشكالية ويضر بشدة الناتجة تفسير. وثمة مسألة شائعة أخرى في هذا البروتوكول هي الحركة الحيوانية أثناء التصوير بالفاصل الزمني. في حين يمكن تصحيح أي تحول xyz بعد التجربة، فمن المستحسن لتصحيح إحداثيات كل موقف قبل كل نقطة زمنية لمنع أي فقدان للمعلومات. تشوه الأنسجة هو مشكلة إضافية وجدت عند التصوير على المجهر المقلوب. تعاني أنسجة الدماغ من الضغط عندما يتم وضع الماوس في وضع السوبين. اعتمادا على درجة تشوه الأنسجة، تتبع الخلايا السرطانية قد يؤدي إلى تحديد كمية خاطئة من إزاحة الخلايا. لمنع ذلك، يمكن استخدام برنامج للتشوه جامدة ومرنة14.
في حين أن هذا الإجراء يقدم تطبيق واسع لدراسة التغييرات في سلوك الورم، ينبغي النظر في بعض القيود. تسمح هذه الطريقة للعلماء بتصوير ما يصل إلى عمق 1.6 مم (باستخدام مذبذب بارامتري بصري)؛ ومع ذلك، وهذا يعني أن التصوير يقتصر على مناطق قشرة الدماغ السطحية15. وهكذا، لا يمكن دراسة بعض أورام الدماغ الموجودة في هياكل الدماغ العميقة العميقة العميقة، بما في ذلك الأورام الدبقية البنوتين ية المنتشرة الموجودة في منطقة جذع الدماغ، في بيئة الدماغ الأصلية مع هذا البروتوكول. وثمة قيد آخر لهذا البروتوكول هو حجم الورم الذي يمكن صورته. على الرغم من أن المسح الكلي لحجم الورم مطلوب للحصول على المعلومات القصوى، في كثير من الأحيان، يمكن أن يكون حجم الورم وسرعة الخلايا المهاجرة عوامل مقيدة. لكل نوع من أنواع الورم، يجب النظر في الفاصل الزمني الأمثل للتصوير. إذا كان الإطار الزمني بين الصور طويلًا جدًا، فقد يكون من الصعب تتبع الخلايا السرطانية. استخدام الماسح الضوئي الرنانة يمكن أن تقلل إلى حد كبير من وقت المسح الضوئي، مما يسمح بتصوير ورم أكبر16. وأخيرا، يمكن أن يكون تحليل الصورة اليدوي لهذا البروتوكول تستغرق وقتا طويلا جدا، لذلك بدلا من ذلك، يمكن استخدام برامج لتتبع 3D الآلي. ومع ذلك، ينبغي دائما أن تكون نتيجة تتبع تحت إشراف بصريا لأن خوارزميات لتتبع الخلايا الآلي نادرا ما تكون مصممة لتلخيص بالضبط هجرة الخلايا ذات الأهمية.
ويمكن للتعديلات الطفيفة على البروتوكول الموصوف هنا أن تمكن طائفة أوسع من التطبيقات. بدلاً من إجراء الخزعات، يمكن تنفيذ تدخلات (جراحية) أخرى، مثل استئصال الورم الجزئي أو تسليم رقاقات العلاج الكيميائي. إضافة المركبات من خلال أنبوب صغير مزروع جراحيا يمكن الجمع بين هذا البروتوكول لاستهداف الجزيئات المحددة ذات الأهمية الدوائية. ونحن نتوقع أن هذا النموذج سوف تكون مفيدة في الدراسات التي تهدف إلى تحليل تأثير تدخل معين على سلوك الخلايا السرطانية. إمكانية تنفيذ تدابير متكررة في نفس الحيوان ليس فقط يوفر بيانات أكثر دقة عن التغيرات التي تحدث في الورم ولكن أيضا يقلل إلى حد كبير من عدد الحيوانات التجريبية اللازمة لكل دراسة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون أنكو دي غراف ومركز هوبريشت للتصوير على دعمهما في التصوير، وإلين ويهرينس وهانا جونسون على التدقيق والتحرير للمخطوطة.
Materials
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
References
- Heuckmann, J. M., Thomas, R. K. A new generation of cancer genome diagnostics for routine clinical use: overcoming the roadblocks to personalized cancer medicine. Annals of Oncology. 26, 1830-1837 (2015).
- van Malenstein, H., et al. Histology obtained by needle biopsy gives additional information on the prognosis of hepatocellular carcinoma. Hepatology Research. 42, 990-998 (2012).
- Kretschmer, L., et al. High incidence of in-transit metastases after sentinel node biopsy in patients with melanoma (Br J Surg 2004; 91: 1370-1371). British Journal of Surgery. 92, 253-254 (2005).
- Alieva, M., et al. Preventing inflammation inhibits biopsy-mediated changes in tumor cell behavior. Scientific Reports. 7, 7529 (2017).
- Hobson, J., et al. Acute inflammation induced by the biopsy of mouse mammary tumors promotes the development of metastasis. Breast Cancer Research Treatment. 139, 391-401 (2013).
- Weil, S., et al. Tumor microtubes convey resistance to surgical lesions and chemotherapy in gliomas. Neuro-Oncology. 19, 1316-1326 (2017).
- Parsa, A. T., et al. Prognostic significance of intracranial dissemination of glioblastoma multiforme in adults. Journal of Neurosurgery. 102, 622-628 (2005).
- Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31, 602-606 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4, 158ra145 (2012).
- Schreurs, T. J., et al. Quantitative Multi-Parametric Magnetic Resonance Imaging of Tumor Response to Photodynamic Therapy. PLOS ONE. 11, e0165759 (2016).
- Nielsen, C. H., et al. PET imaging of tumor neovascularization in a transgenic mouse model with a novel 64Cu-DOTA-knottin peptide. 암 연구학. 70, 9022-9030 (2010).
- Alieva, M., et al. Glioblastoma therapy with cytotoxic mesenchymal stromal cells optimized by bioluminescence imaging of tumor and therapeutic cell response. PLOS ONE. 7, e35148 (2012).
- Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. Dendra2 photoswitching through the Mammary Imaging Window. Journal of Visualized Experiment. (28), e1278 (2009).
- Noordmans, H. J., Roode, R. d., Staring, M., Verdaasdonk, R. . Registration and analysis of in vivo multispectral images for correction of motion and comparison in time. , (2006).
- Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16, 106014 (2011).
- Kirkpatrick, N. D., et al. Video-rate resonant scanning multiphoton microscopy: An emerging technique for intravital imaging of the tumor microenvironment. IntraVital. 1, (2012).
