הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי

שלפוחיות (EVs) קיימות בכל נוזלי הגוף, כולל דם, שתן, רוק, חלב ונוזל השפיר. אקסוזומים טופס מחלקה מחוז של EVs הבדיל מתוך EVs אחרים על ידי ביוגנזה אנדוזומבית, סמנים של השביל האנדוזומבית, ואת הגודל הקטן ביותר בין כל EVs. הגודל של האקסוזומים מדווח לעתים קרובות עם שינויים ניכרים בין הלימודים. תוצאות שינוי גודל נמצאו להיות תלויים שיטה, המשקף את ההבדל בעקרונות פיזיים המועסקים על ידי טכניקות אנליטיות שונות כדי להעריך EV גדלים^1,2. לדוגמה, ניתוח המעקב הננו-חלקיק (נ. ת. ע)-טכניקת האפיון בגודל הנפוץ ביותר-מעריך את הגודל של EVs כקטרים ההידרודינמיים שלהם, המאפיינים את ההתנגדות לניידות הבראונית של EVs בפתרון. קוטר הידרודינמי גדול יותר של שלפוחית מרמזת על הניידות הנמוכה שלה בנוזל. השכבה הקורלית סביב שלפוחיות, המורכב של חלבונים פני השטח ומולקולות אחרות מעוגן או נספחת אל פני הקרום, מאוד מעכבת את הניידות ומגבירה את הגודל ההידרודינמי של EVs. במונחים יחסיים, גידול זה גדול במיוחד עבור האקסוזומים³, כפי שמודגם באיור 1.

שידור הקריוגני (המיקרוסקופיה) הוא טכניקה מוחלטת באפיון גדלים ומורפולוגיה במדינות ההתייבשות. עם זאת, את העלות הגבוהה של המכשור ואת המומחיות המקצועית הדרושים כדי להשתמש בו נכון להמריץ את החקירה של טכניקות חלופיות שיכול לEVs נוזלים. מספר קטן יחסית של EVs שנצפו או מאופיין בתמונות הקריו-TEM הנרכשים, הוא חיסרון בולט נוסף של טכניקה זו.

מיקרוסקופ כוח אטומי (afm) לדמיין את הטופוגרפיה תלת מימדי של רטוב או מיובש EVs^4,5,6 על ידי סריקת בדיקה על פני המצע כדי לסרוק את התמונה של החלקיקים על פני השטח. הצעדים החיוניים של הפרוטוקול לאפיון EVs על ידי AFM מתוארים במחקר זה. לפני הדמיה של שלפוחיות בנוזל, הם חייבים להיות מקיבוע על מצע על ידי הקשירה למשטח פונקציונליזציה, השמנה במסנן, או על ידי משיכה אלקטרוסטטית⁷. הקיבעון האלקטרוסטטי על מצע טעונה באופן חיובי הוא אופציה נוחה במיוחד עבור השתק של אקזומים הידוע כי יש פוטנציאל זטה שלילי. עם זאת, את אותם כוחות אלקטרוסטטית ששתק את שלפוחיות החילוץ על פני השטח גם לעוות את צורתם, מה שהופך ניתוח נתונים לאחר הדמיה חיוני. אנו להרחיב נקודה זו על ידי תיאור האלגוריתם המתאר את הגודל של כדורי שלפוחיות בפתרון מבוסס על נתוני AFM על הצורה מעוותת של האקסוזומים מקיבוע על פני השטח.

בפרוטוקול המפותח מוצג הנוהל של הטיפול הסטטי של השלפוחיות ולאחריו השלבים הדרושים לביצוע הדמיה של כוח אטומי במצבי היובש או ההתייבשות. הגורמים המשפיעים על הריכוז של פני השטח של השלפוחית הקיבוע מזוהים. ההדרכה ניתנת על איך לבצע את השתק אלקטרוסטטי עבור דגימות עם ריכוזים שונים של EVs בפתרון. הבחירה של התנאים הניסיוניים המתיר הערכה של הפצות ההסתברות האמפירית של מאפיינים ביופיזיים שונים המבוססים על מספר גדול מספיק של קיבוע ושלפוחיות הוא נדון. דוגמאות לניתוח לאחר הדמיה של נתוני AFM ניתנים. באופן ספציפי, אלגוריתם מתואר לקביעת גודל ושלפוחיות בתמיסה המבוססת על אפיון AFM של קיבוע EVs. תוצאות הנציג להראות את העקביות של שלפוחית האחיזה על ידי AFM עם התוצאות של הדמיה הקפאה-TEM.