Bildgebung von extrazellulären Vesikeln durch Atomkraftmikroskopie

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind in allen Körperflüssigkeiten vorhanden, einschließlich Blut, Urin, Speichel, Milch und der Fruchtwasser. Exosomen bilden eine Bezirksklasse von Elektrofahrzeugen, die sich durch endosomale Biogenese, die Marker des endosomalen Weges und die kleinste Größe unter allen Elektrofahrzeugen von anderen Elektrofahrzeugen unterscheiden. Die Größe der Exosomen wird oft mit erheblichen Schwankungen zwischen den Studien berichtet. Die Größenergebnisse waren methodisch abhängig, was den Unterschied in den physikalischen Prinzipien widerspiegelt, die von verschiedenen Analysetechniken zur Schätzung der EV-Größen^1,2verwendet werden. Beispielsweise schätzt die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) – die am weitesten verbreitete Größencharakterisierungstechnik – die Größe von Elektrofahrzeugen als ihre hydrodynamischen Durchmesser, die den Widerstand gegen die Brownsche Mobilität von Elektrofahrzeugen in der Lösung charakterisieren. Ein größerer hydrodynamischer Durchmesser eines Vesikels impliziert seine geringere Beweglichkeit in Flüssigkeit. Die koronale Schicht um Vesikel, bestehend aus Oberflächenproteinen und anderen Molekülen, die an der Membranoberfläche verankert oder adsorbiert werden, behindert die Beweglichkeit erheblich und erhöht die hydrodynamische Größe von Elektrofahrzeugen. Relativ gesehen ist dieser Anstieg besonders groß für die Exosomen³, wie in Abbildung 1dargestellt.

Die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM) ist eine definitive Technik zur Charakterisierung von Vesikelgrößen und Morphologie in ihren hydratisierten Zuständen. Die hohen Kosten der Instrumentierung und das für ihre korrekte Verwendung erforderliche Fachwissen motivieren jedoch die Erforschung alternativer Techniken, die hydratisierte Elektrofahrzeuge abbilden können. Eine relativ kleine Anzahl von EVs, die in den erfassten Kryo-TEM-Bildern beobachtet oder charakterisiert werden, ist ein weiterer bemerkenswerter Nachteil dieser Technik.

Die Atomkraftmikroskopie (AFM) visualisiert die dreidimensionale Topographie hydratisierter oder ausgetrockneter Elektrofahrzeuge^4,5,6, indem eine Sonde über das Substrat gescannt wird, um das Bild der Partikel auf der Oberfläche zu rastern. Die wesentlichen Schritte des Protokolls zur Charakterisierung von Elektrofahrzeugen durch AFM werden in dieser Studie beschrieben. Bevor die Vesikel in Flüssigkeit abgeglichen werden, müssen sie auf einem Substrat immobilisiert werden, indem sie entweder an eine funktionalisierte Oberfläche binden, in einem Filter einfangen oder durch elektrostatische Anziehung⁷. Die elektrostatische Fixierung auf einem positiv geladenen Substrat ist eine besonders praktische Option zur Immobilisierung von Exosomen, von der bekannt ist, dass sie ein negatives Zeta-Potenzial hat. Die gleichen elektrostatischen Kräfte, die die extrazellulären Vesikel auf der Oberfläche immobilisieren, verzerren jedoch auch ihre Form, was eine post-imaging-Datenanalyse unerlässlich macht. Wir erarbeiten diesen Punkt, indem wir den Algorithmus beschreiben, der die Größe der Kugelbläschen in der Lösung auf der Grundlage der AFM-Daten über die verzerrte Form der auf der Oberfläche immobilisierten Exosomen schätzt.

Im entwickelten Protokoll wird das Verfahren zur robusten elektrostatischen Immobilisierung von Vesikeln vorgestellt und mit den Schritten verfolgt, die für die Durchführung der Atomkraft-Bildgebung in den hydratisierten oder ausgetrockneten Zuständen erforderlich sind. Die Faktoren, die die Oberflächenkonzentration der immobilisierten Vesikel beeinflussen, werden identifiziert. Es wird die Anleitung gegeben, wie die elektrostatische Immobilisierung für Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen von Elektrofahrzeugen in der Lösung durchgeführt werden kann. Diskutiert wird die Auswahl von Versuchsbedingungen, die die Schätzung empirischer Wahrscheinlichkeitsverteilungen verschiedener biophysikalischer Eigenschaften auf der Grundlage einer ausreichend großen Anzahl von immobilisierten Vesikeln ermöglichen. Beispiele für die nach-Imaging-Analyse der AFM-Daten werden angeführt. Insbesondere wird ein Algorithmus zur Bestimmung der Größe von Vesikeln in der Lösung beschrieben, basierend auf der AFM-Charakterisierung von immobilisierten Elektrofahrzeugen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die Konsistenz der Vesikelgröße durch AFM mit den Ergebnissen der Kryo-TEM-Bildgebung.