原子力显微镜对细胞外囊泡的成像

细胞外囊泡 （EV） 存在于所有体液中，包括血液、尿液、唾液、牛奶和羊水。外体体形成一个区域类别的EV与其他EV不同，通过内生，内生子途径的标记，和所有EV中最小的尺寸。外体体的大小经常被报告，在研究之间有很大的变异性。大小调整结果与方法相关，反映了不同分析技术用于估计EV^尺寸1，2的物理原理的差异。例如，纳米粒子跟踪分析 （NTA） 是使用最广泛的尺寸表征技术，它估计了 EV 的大小作为流体动力学直径，该直径描述了溶液中 EV 对布朗流动性的阻力。囊泡的流体动力学直径越大，意味着它在液体中的流动性较低。囊泡周围的冠状层，由表面蛋白质和其他固定在膜表面或吸附的分子组成，严重阻碍流动性，增加EV的流体动力学尺寸。相对而言，这种增加对于外体^体3来说特别大，如图1所示。

低温透射电子显微镜（低温-TEM）成像是描述囊泡大小和形态在其水合状态的明确技术。然而，仪器的高成本和使用它所需的专业知识正确地激发了对可成像水合电动汽车的替代技术的探索。在采集的低温-TEM 图像中观察到或特征的 EV 数量相对较少，是该技术的另一个显著缺点。

原子力显微镜（AFM）通过扫描基板上的探针来栅格显示表面粒子的图像，从而可视化水合或^{干燥EV4、5、6}的三维地形。本研究概述了协议对AFM的EV特征的基本步骤。在液体中成像囊泡之前，必须将其固定在基板上，通过系绳到功能化表面、困在过滤器中或静电吸引力⁷。在带正电基板上的静电固定是一种特别方便的选择，用于对已知具有负Zeta电位的外体体进行固定。然而，固定表面细胞外囊泡的同样的静电力也会扭曲其形状，这使得成像后数据分析变得至关重要。我们通过描述基于固定在表面上的外体体变形形状的AFM数据估计溶液中球状囊泡大小的算法来阐述这一点。

在已开发的协议中，介绍了囊泡强稳定处理程序，并随后介绍了在水合或干燥状态下执行原子力成像所需的步骤。确定了影响固定囊泡表面浓度的因素。指导如何对溶液中不同浓度的EV样品进行静电固定。讨论了基于足够数量的固定囊泡估计不同生物物理特性的经验概率分布的实验条件的选择。给出了AFM数据成像后分析的例子。具体来说，描述了一种算法，用于根据固定性EV的AFM特征来确定溶液中囊泡的大小。具有代表性的结果表明AFM的囊泡大小与低温-TEM成像结果的一致性。