成人海馬神経前駆細胞のアッセイ回路特異的調節

成人神経新生は、新しいニューロンが成人で生まれ、既存のニューラルネットワーク1に統合される生物学的プロセスである。ヒトでは、このプロセスは海馬の歯状ジャイル(DG)で起こり、そこでは毎日約1,400個の新しい細胞が2^日に生まれる。これらの細胞は、神経原性ニッチを有するDGの内側の部分に存在し、粒状帯(SGZ)と呼ぶ。ここでは、海馬成人神経幹細胞(NSC)は、学習と記憶、気分調節、ストレス応答を含む特定の脳機能の調節に寄与する完全に機能するニューロンになるために複雑な発達過程を経^{る3 ,4,5,6}.行動に影響を与えるために、成人NSCは、局所的および遠位的な化学的手がかりの配列に応答することにより、活動依存的な方法で様々な外部刺激によって高度に規制されています。これらの化学的手がかりは、神経伝達物質と神経調節剤を含み、様々な脳領域から回路固有の方法で作用します。重要なことに、NSC上のこれらの化学的手がかりの回路広い収束は、幹細胞の活性化、分化、および運命の決定のユニークで正確な調節を可能にします。

生体内の成人NSCの回路調節を調知する最も効果的な方法の1つは、免疫蛍光解析と回路広い操作を組み合わせることによってです。成体NSCの免疫蛍光分析は、特定の分子マーカーに対する抗体が成人NSCの発達段階を示すために使用される一般的に利用される技術である。これらのマーカーには、ラジアルグリア細胞および初期神経前駆マーカーとしてのネスチン、中間前駆マーカーとしてのTbr2、神経芽細胞および未熟ニューロン^{マーカー7}としてのdcxが含まれる。さらに、BrdU、CidU、Idu、およびEduなどのチミジン類似体を投与することにより、S相を受けている細胞集団を個別に標識および可視化することができ、8、9、10^である。これら2つのアプローチを組み合わせることで、特定の発達段階での増殖がどのように調節されるのか、様々な手がかりがNSC分化や神経新生にどのように影響するかまで、幅広い疑問を調査することができます。

電気刺激、光遺伝学、化学遺伝学などの神経回路を効果的に操作するには、それぞれに長所と短所を持ついくつかのオプションがあります。電気刺激は、電極が後で標的脳領域を調節するために電気信号を送信するために使用される特定の脳領域に移植される広範な手術を伴う。ただし、このアプローチにはセルラーと回路の両方の特異性が欠けています。光遺伝学は、埋め込まれた光ファイバーを通して放出されるレーザーによって刺激される光活性化受容体をコードするウイルス粒子の送達を含むが、広範な操作、大きなコスト、および複雑な手術^を必要とする11。化学遺伝学は、デザイナー薬またはDREADDsによって排他的に活性化されるデザイナー受容体をコードするウイルス粒子の送達を含み、その後、クロザピンN-オキシド(CNO)として知られている特定の生物学的不活性リガンドによって活性化^される12.DREADDを利用して成人NSCを調節する局所的な神経回路を操作する利点は、CNO管理の容易さと様々な経路にあります。これにより、動物の取り扱いを減らして時間のかかるアプローチが可能となり、神経回路を調節するための長期研究に容易に適応できます。

このプロトコルに記載されているアプローチは、免疫蛍光技術と回路操作の両方を組み合わせた成人海馬神経新生の回路調節を正常に調知するために必要な様々なプロトコルの包括的なコレクションです。化学遺伝学を使用して。以下のプロトコルに記載の方法は、成体神経新生に対するそれらの調節機能を決定するために、生体内で同時に1つまたは複数の回路を刺激または阻害するのに適している。この方法は、質問に高度な時間分解能が必要ない場合に最適です。特定の周波数での刺激/阻害の正確な時間的制御を必要とする質問は、光遺伝学13、14を使用してより良い対処することができる。ここで説明するアプローチは、特にストレスが主要な懸念事項である場合、最小限の動物の取り扱いを伴う長期的な研究に容易に適合する。