Che overexpressing lunghi non codificanti RNA utilizzando CRISPR Gene-attivante
Summary
Tecniche tradizionali basati su cDNA sovraespressione hanno una limitata applicabilità per la sovraespressione di RNA lunghi non codificanti a causa del loro più moduli di giunzione con funzionalità potenziale. Questa revisione segnala un protocollo utilizzando la tecnologia CRISPR per overexpress più varianti di splicing di un RNA lunghi non codificante.
Abstract
Lungo non codificanti RNA (lncRNA) biologia è un nuovo ed eccitante campo di ricerca, con il numero di pubblicazioni da questo settore in crescita esponenziale dal 2007. Questi studi hanno confermato che lncRNAs sono alterati in quasi tutte le malattie. Tuttavia, studiando i ruoli funzionali per lncRNAs nel contesto della malattia rimane difficile a causa della mancanza di prodotti proteici, espressione tessuto-specifica, i livelli di espressione bassa complessità nelle forme della giuntura e mancanza di conservazione tra specie. Dato l’espressione specie-specifica, gli studi lncRNA sono spesso limitati ai contesti di ricerca umana quando lo studio dei processi di malattia. Poiché lncRNAs funzionare a livello molecolare, un modo di sezionare lncRNA biologia è di rimuovere il lncRNA o dei overexpress gli effetti cellulari lncRNA e misura. In questo articolo, è presentato un protocollo scritto e visualizzato in quel momento ai overexpress lncRNAs in vitro. Come un esperimento rappresentanza, un lncRNA associato a malattia infiammatoria intestinale, l’interferone Gamma antisenso 1 (IFNG-AS1), è indicato per essere sovraespresso in un modello di T-cellula di Jurkat. A tale scopo, l’attivazione tecnica regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) cluster è possibile abilitare sovraespressione ai loci genomici endogeni. La tecnica d’attivazione di CRISPR si rivolge a un insieme di fattori di trascrizione per il sito di inizio trascrizionale di un gene, consentendo una robusta sovraespressione di molteplici forme di giuntura lncRNA. Questa procedura verrà essere suddivisi in tre passi, vale a dire (i) guida RNA (gRNA) progettazione e vettore di costruzione, (ii) virus generazione e trasduzione e screening (iii) Colonia per sovraespressione. Per questo esperimento rappresentanza, un maggiore di 20 volte aumento in IFNG-AS1 in cellule di T di Jurkat è stato osservato.
Introduction
Mentre la ricerca biomedica più è incentrato su trascrizioni di proteina-codificazione, la maggior parte dei geni trascritti in realtà consiste di RNA non codificanti (Ensembl rilascio 93). La ricerca attuale sta cominciando ad esplorare questo campo, con il numero di pubblicazioni su lncRNAs nei processi di malattia aumenta in modo esponenziale tra 2007 e 20171. Queste pubblicazioni dimostrano che molti lncRNAs sono associate con la malattia. Tuttavia, i meccanismi molecolari di questi lncRNAs sono difficili da studiare a causa di loro diverse funzioni rispetto al mRNA. Ad aggravare il problema della comprensione del ruolo di lncRNAs nella malattia, lncRNAs sono spesso espressi a livelli inferiori a codificazione RNAs2. Inoltre, lncRNAs sono mal conservati, che limita gli studi funzionali in umani-cell-linea-based tecniche3. Un metodo per studiare il meccanismo di questi nuovi geni consiste in modo endogeno iperesprimono li in cellule coltivate. Sovraespressione studi possono fornire le principali informazioni per quanto riguarda la funzione dei geni specifici e consentire ai ricercatori di sezionare vie molecolari chiave.
Un nuovo metodo per attivare la trascrizione dei geni di lncRNA si basa su tecnologie CRISPR sviluppati inizialmente da Gersbach laboratorio4. Questo protocollo è stato adattato per uso in biologia di lncRNA e per l’espressione di questi geni in altri sistemi-modello. In CRISPR che overexpressing tecnica, una proteina chiamata proteina CRISPR 9 (Cas9) può essere diretto verso una sequenza di DNA tramite una gRNA antisenso che viene riconosciuto da Cas9. Normalmente, Cas9 indurranno la fenditura del DNA; Tuttavia, mutazioni in Cas9, precedentemente sviluppato per la tecnica di sovraespressione, disattivare questo passaggio5. Quando un attivatore trascrizionale è fusa ad un “morto” Cas9 (dCas9) e trasformata in linee cellulari, la sovraespressione endogena di lncRNAs può essere raggiunto4,6. L’aggiunta di ulteriori modifiche per il gRNA, consentendo ulteriori fattori trascrizionali di associare il gRNA, aumentato l’efficacia del sistema di attivazione del gene di dCas9 10 volte7. D’importanza, è stato dimostrato che l’attivazione trascrizionale richiede vicinanza (< 200 bp) iniziare la trascrizione geni sito, consentendo un upregulation specifici in aree ricche di gene7. A differenza delle tecnologie di knockout CRISPR, dCas9 e gRNA cassette devono essere integrati nel genoma per consentire le cellule a mantenere una sovraespressione nel corso di più generazioni. Un metodo per raggiungere questo obiettivo è utilizzare lentivirus per integrare le cassette contenenti dCas9 e gRNA. Dopo l’integrazione, l’espressione del gene di lncRNA può essere determinato.
In questo articolo, verrà dimostrato un protocollo per la sovraespressione di lncRNA in un modello di T-cellula di Jurkat. Una procedura dettagliata viene visualizzata e può essere adattata anche a cellule aderenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo manoscritto presenta un protocollo per l’utilizzo di attivazione CRISPR per overexpress lncRNAs in vitro. Si tratta di una tecnica particolarmente importante quando si studia a lungo non codificanti RNA come il prodotto di trascrittomica è l’unità funzionale. Dopo sovraespressione, il ricercatore può, quindi, utilizzare queste cellule per aumentare il rapporto segnale-rumore quando lo studio partner di legame e anche misurare le conseguenze cellulari di aumento dei livelli di lncRNAs. Come lncRNAs frequentement…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.P. è supportato da DK60729 RO1 e P30 DK 41301-26. D.P. è supportato dal career development award di Crohn & colite Foundation (CCFA), cura: centro di ricerca Malattie Digestive (DDRC) DK41301 e UCLA clinica e traslazionale Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. Il nucleo di virologia UCLA è stato finanziato dal centro di ricerca del AIDS (CFAR) concedere 5P 30 AI028697. Le tecnologie molecolari integrate di UCLA core è stato sostenuto dalla cura/P30 concedere DK041301. Questo lavoro è stato supportato anche dall’istituto UCLA AIDS.
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
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