Surexprimant ARN Long non codantes en utilisant activation génique CRISPR
Summary
Techniques traditionnelles axées sur l’ARNC surexpression ont une portée limitée pour la surexpression de l’ARN long non codantes en raison de leurs multiples formes d’épissure avec fonctionnalité potentielle. Cette étude rapporte un protocole utilisant la technologie CRISPR pour surexprimer multiples variants d’épissage d’un ARN long non codant.
Abstract
Longtemps non codante biologie des ARN (lncRNA) est un domaine nouveau et passionnant de recherche, avec le nombre de publications de ce domaine en croissance exponentielle depuis 2007. Ces études ont confirmé que les lncRNAs soient modifiées dans presque toutes les maladies. Toutefois, il reste difficile en raison du manque de produits protéiques, expression tissu-spécifique, les niveaux d’expression faible complexité sous formes d’épissage et de la conservation des espèces d’étudier les rôles fonctionnels pour lncRNAs dans le contexte de la maladie. Compte tenu de l’expression spécifique à l’espèce, lncRNA études se limitent souvent aux contextes de recherche humaine lorsque l’on étudie les processus morbides. Étant donné que lncRNAs fonctionne au niveau moléculaire, disséquer la biologie lncRNA consiste à enlever la lncRNA ou surexpriment les effets cellulaires lncRNA et mesure. Dans cet article, un protocole écrit et visualisé de surexprimer lncRNAs in vitro est présenté. Comme une expérience représentative, une lncRNA associée à la maladie intestinale inflammatoire, l’interféron Gamma antisens 1 (IFNG-AS1), s’est avéré être surexprimé dans un modèle de cellules T Jurkat. Pour ce faire, la technique activateur de régulièrement dois‑je courts palindromes répétitions (CRISPR) en cluster est utilisée pour permettre à la surexpression dans les locus génomiques endogènes. La technique CRISPR activation vise un ensemble de facteurs de transcription sur le site de début de transcription d’un gène, qui permet une surexpression robuste de multiples formes d’épissure de lncRNA. Cette procédure va être décomposée en trois étapes, à savoir (i) guide RNA (gRNA) conception et vector construction, génération de virus (ii) et transduction et criblage de colonie (iii) pour la surexpression. Pour cette expérience représentative, a plus de 20 fois amélioration dans IFNG-AS1 dans les cellules T Jurkat a été observée.
Introduction
Alors que la recherche biomédicale plus a porté sur transcrits codant pour des protéines, la majorité des gènes transcrits se compose en réalité d’ARN non codants (Ensembl release 93). La recherche actuelle commence à explorer ce domaine, avec le nombre de publications sur lncRNAs dans le processus de la maladie augmente de façon exponentielle entre 2007 et 20171. Ces publications démontrent que de nombreux lncRNAs sont associés aux maladies. Cependant, les mécanismes moléculaires de ces lncRNAs sont difficiles à étudier en raison de leurs fonctions diverses de mRNA. Le problème de la compréhension du rôle de lncRNAs dans la maladie de mélange, lncRNAs s’expriment souvent à des niveaux inférieurs que coding RNAs2. En outre, lncRNAs sont mal conservées, qui limite les études fonctionnelles dans l’homme cellulaire-ligne-techniques basées sur3. Une méthode pour étudier le mécanisme de ces nouveaux gènes consiste à eux surexpriment endogène dans les cellules cultivées. Surexpression études peuvent fournir des renseignements essentiels quant à la fonction des gènes spécifiques et permettre aux chercheurs de disséquer les voies moléculaires clés.
Une nouvelle méthode pour activer la transcription des gènes de lncRNA repose sur les technologies CRISPR développés initialement par le laboratoire de Gersbach4. Ce protocole a été adapté pour une utilisation en biologie de la lncRNA et pour l’expression de ces gènes dans d’autres systèmes de modèle. Dans le CRISPR surexprimant la technique, une protéine appelée protéine associée à la CRISPR 9 (Cas9) peut être dirigée vers une séquence d’ADN via un gRNA antisens qui est reconnu par Cas9. Normalement, Cas9 induira de clivage de l’ADN ; Toutefois, des mutations Cas9, précédemment mis au point pour la technique de la surexpression, désactiver cette étape5. Quand un activateur de la transcription est fusionné à un Cas9 « morts » (dCas9) et transduites dans les lignées cellulaires, la surexpression endogène de lncRNAs peut être obtenu4,6. L’addition de modifications supplémentaires à la gRNA, permettant aux autres facteurs transcriptionnels lier à la gRNA, augmente l’efficacité du système d’activation gène dCas9 10 fois7. Ce qui est important, il a été démontré que l’activation de la transcription exige proximité (< 200 bp) demarre la transcription des gènes de site, ce qui permet une augmentation spécifique dans les zones riches en gènes7. Contrairement aux technologies de knockout CRISPR, dCas9 et gRNA cassettes doivent être intégrés dans le génome permettant aux cellules de conserver une surexpression sur plusieurs générations. Une méthode pour y parvenir consiste à utiliser des lentivirus pour intégrer les cassettes contenant dCas9 et gRNA. Après intégration, on peut déterminer l’expression du gène lncRNA.
Dans cet article, un protocole pour lncRNA surexpression dans un modèle de cellules T Jurkat sera démontré. Une procédure pas à pas apparaît et peut également être adaptée pour les cellules adhérentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce manuscrit présente un protocole permettant d’utiliser l’activation CRISPR pour surexprimer lncRNAs in vitro. Il s’agit d’une technique particulièrement importante lorsque l’on étudie les ARN long non codantes puisque le produit de transcriptomique est l’unité fonctionnelle. Après surexpression, le chercheur peut, ensuite, utiliser ces cellules pour augmenter le rapport signal-bruit lorsque l’on étudie les partenaires de liaison et même de mesurer les conséquences cellulaires d’augmentation du lncRN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.P. est pris en charge par DK60729 RO1 et P30 DK 41301-26. D.P. est pris en charge par un Crohn & Colitis Foundation (CCFA) career development award, CURE : centre de recherches des maladies digestives (DDRC) DK41301 et UCLA clinique et translationnelle Science Institute (ILEC) UL1TR0001881. Le noyau de virologie UCLA a été financé par le centre de recherche sida (CFAR) accorder 5P 30 AI028697. Les Technologies intégrées moléculaire de UCLA core a été pris en charge par CURE/P30 accorder DK041301. Ce travail a été également soutenu par l’Institut de sida de UCLA.
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
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