使用基因激活 crispr 过度表达长非编码 rna

虽然大多数生物医学研究都集中在蛋白质编码转录记录上, 但大多数转录基因实际上是由非编码 rna (ensembl 发布 93) 组成的。目前的研究开始探索这一领域, 2007年至2017年期间, 关于疾病过程中的 inrna 的出版物数量呈指数级增长¹。这些出版物表明, 许多 inrna 与疾病有关。然而, 与 mrna 相比, 这些神经网络的分子机制由于其功能不同而难以研究。使理解信息素的作用的问题更加复杂, 而英特罗 a 的表达水平往往低于编码 rna²。此外, 英特拉 a 的保守程度很低, 这限制了基于人的技术的功能研究³。研究这些新基因机制的一种方法是在培养的细胞中内源过度表达它们。过度表达研究可以提供有关特定基因功能的关键信息, 并使研究人员能够剖析关键的分子途径。

一种激活 lncRNA 基因转录的新方法是基于 gersbach 实验室^最初开发的 crispr 技术。该协议已被改编用于英卡纳生物学和这些基因在其他模型系统中的表达。在 crispr 过度表达技术中, 一种名为 crispr 相关蛋白 9 (cas9) 的蛋白质可以通过 cas9 识别的反义 grna 指向 dna 序列。通常情况下, cas9 会诱导 dna 裂解;然而, 以前为过度表达技术开发的 cas9 中的突变会停用这一步骤⁵。当转录激活剂融合到 “死” cas9 (dcas9) 并转化为细胞系时, 就能实现 ncrna 的内源性过度表达 4^,6。添加了对 grna 的额外修饰, 使额外的转录因子与 grna 结合, 提高了 dcas9 基因激活系统的疗效 10倍^7倍。重要的是, 它表明, 转录激活需要接近 (和 lt;200 bp) 转录起始位基因, 使一个特定的隆起地区⁷。与 crispr 淘汰赛技术不同, dcas9 和 grna 盒式磁带需要集成到基因组中, 以允许细胞在多代人的多代中保持过度表达。实现这一目标的一种方法是使用慢病毒集成含有 dcas9 和 grna 的盒式磁带。整合后, 可以确定英克斯拉基因的表达。

在本文中, 将演示一种在 jurkat t 细胞模型中过度表达的协议。一个循序渐进的过程显示, 也可以适应粘附细胞。