באמצעות מקור פתוח MALDI תוף-MS IDBac הניתוח של חלבון מיקרוביאלית ונתונים מיוחדים מטבוליט
Summary
IDBac הוא מקור פתוח המסה ספקטרומוטוריקה מבוססי צינור ביואינפורמטיקה המשלבת נתונים מחלבונים שלמים, ספקטרום מטבוליזם מיוחדים, שנאסף על החומר הנייד מגורד ממושבות חיידקי. צינור מאפשר לחוקרים לארגן במהירות מאות אלפי מושבות חיידקי לתוך קבוצות מטקמיים ועוד להבדיל אותם מבוסס על ייצור מטבוליזם המקצועית.
Abstract
על מנת להמחיש את היחסים בין בקטריאלי תולדות והפקה מטבוליזם המקצועית של מושבות חיידקי גדל על מזינים אגר, פיתחנו idbac-בעלות נמוכה ותפוקה גבוהה באמצעות מטריצה לייזר בסיוע בלייזר/יינון ביומוטמטריה (MALDI-תוף MS)-הצינור הגדול של הטיסה. תוכנת IDBac מיועד שאינם מומחים, הוא זמין באופן חופשי, ומסוגל לנתח כמה אלפי מושבות חיידקי. כאן, אנו מציגים הליכים להכנת מושבות חיידקי לניתוח MS MALDI-תוף, הפעלת כלי MS, עיבוד נתונים והדמיה ב-IDBac. בפרט, אנו מורים למשתמשים כיצד לאשכול חיידקים לתוך העצים בהתבסס על טביעות אצבעות חלבון MS ו אינטראקטיבי ליצור רשתות האגודה מטבולייט (מאנס) מתוך נתונים מיוחדים מטבוליזם.
Introduction
מחסום מרכזי לחוקרים הלומדים פונקציה חיידקית היא היכולת להעריך במהירות ובו בו את הזהות הטקקיות של מיקרואורגניזם ויכולתו לייצר מטבוליטים מיוחדים. זה מנע התקדמות משמעותית בהבנת הקשר בין הקימוט החיידקי וייצור מטבוליזם מיוחדים ברוב החיידקים מבודדים מהסביבה. למרות שיטות מבוססות MS המשתמשות בטביעות אצבע של חלבונים לקבוצה וזיהוי חיידקים מתוארים היטב1,2,3,4, מחקרים אלה בדרך כלל בוצעו על קבוצות קטנות של בודד, באופן ספציפי למין. חשוב מכך, מידע על ייצור מטבוליזם מיוחדים, הנהג העיקרי של תפקוד חיידקים בסביבה, נשאר משולב במחקרים אלה. סילבה ואח ‘5 לאחרונה סיפקה היסטוריה מקיפה המפרט את השימוש התחתון של MALDI-תוף MS לנתח מטבוליטים מיוחדים ומחסור של תוכנה כדי להקל על צווארי בקבוק הנוכחי בביואינפורמטיקה. על מנת לטפל בחסרונות אלה, יצרנו IDBac, צינור ביואינפורמטיקה המשלב הן ליניארי ו הרפלקסים של מצבי MALDI-תוף MS6. זה מאפשר למשתמשים להמחיש במהירות ולהבדיל חיידקי בודד מבוסס על החלבון הן מטבוליזם וטביעות אצבעות MS מיוחדים, בהתאמה.
IDBac הוא חסכוני, תפוקה גבוהה, ומיועד המשתמש שכבה. היא זמינה באופן חופשי (chasemc.github.io/IDBac), ומחייבת גישה לספקטרומטר מסה של MALDI-תוף (במצב של הרפלקסים הדרושים לניתוח מטבוליזם). הכנה לדוגמא מסתמכת על השיטה הפשוטה “המורחבת ישירה” שיטה7,8 ונתונים נאספים עם ברציפות ליניארי ו-הרפלקסים של רכישות במקום יחיד maldi-יעד. עם IDBac, אפשר לנתח את הקימוט הפוטוטיבית וייצור מטבוליזם מיוחדות של מאות מושבות בפחות מארבע שעות, כולל הכנה לדוגמא, רכישת נתונים, ויזואליזציה של נתונים. זה מציג זמן משמעותי ויתרון עלות על שיטות מסורתיות של זיהוי חיידקים (כגון רצף גנים), וניתוח פלט מטבולית (כרומטוגרפיה נוזלית המסה ספקטרומטריה [LCMS] ושיטות כרומוגרפיות דומות).
באמצעות נתונים שהושגו בניתוח מצב ליניארי, IDBac משתמש באשכולות הירארכיים כדי לייצג את המצב החדש של ספקטרום החלבונים. כיוון שהספקטרום מייצג בעיקר חלבונים ריבוזומניים, הם מספקים ייצוג של הגיוון הפילוגנטי הקיים במדגם. בנוסף, IDBac משלבת רפלקסים במצב נתונים כדי להציג טביעות אצבעות מיוחדות לייט מטבוליזם כמו רשתות האגודה מטבוליט (מאנס). מאמינים הם רשתות דו-צדדי המאפשרים הדמיה קלה של ייצור המטמיטבוליט משותף ייחודי בין בודד בקטריאלי. הפלטפורמה IDBac מאפשר לחוקרים לנתח הן חלבונים ונתוני מטבוליזם מיוחדים בטנדם, אבל גם בנפרד, אם רק אחד מסוג הנתונים הוא רכשה. חשוב מכך, IDBac מעבד נתונים גולמיים מ Bruker ו ש’יאמן מכשירים, כמו גם txt, tab, csv, mzXML, ו Mzxml. פעולה זו מבטלת את הצורך בהמרה ידנית ובעיצוב של ערכות נתונים, ומפחיתה באופן משמעותי את הסיכון של שגיאת משתמש או משנה של נתוני MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול IDBac פרטים חלבון חיידקי והתמחה מטבוליזם נתונים רכישה וניתוח של עד 384 חיידקי בודד 4 h על ידי חוקר אחד. עם idbac אין צורך לחלץ DNA מבודד בקטריאלי או ליצור תמציות מטבוליט מיוחדות מתוך התסיסה נוזלי ולנתח אותם באמצעות שיטות כרומטוגרפי. במקום זאת, חלבונים ונתונים מטבוליזם מיוחדים נאספים על ידי הפצת חומר פשוט ממושבות חיידקי ישירות על צלחת היעד MALDI. זה מפחית במידה ניכרת את הזמן ואת העלות הקשורים טכניקות חלופיות כגון רצף הגנים של 16 rRNA ו LCMS9.
חשוב להוסיף כתמים של מטריצה ריקה וכיול ללוח MALDI, ואנו ממליצים להשתמש במספר מתאים של שכפול כדי להבטיח שימוש בלתי מוצפן ובטחון סטטיסטי. מספרי השכפל יהיו תלויי-ניסוי. לדוגמה, אם משתמש מתכוון להבדיל בין אלפי מושבות מאוסף של לוחות גיוון סביבתי, ייתכן שיהיה צורך בפחות משכפל (המעבדה שלנו אוספת שלושה משכפל טכני לכל מושבה). לחילופין, אם משתמש מבקש ליצור מסד נתונים מותאם אישית של זנים מתוך מטקבקטריאלי ספציפיים כדי לקבוע במהירות סיווגים תת מיני של מבודד לא ידוע, אז משכפל יותר מתאים (המעבדה שלנו אוספת שמונה משכפל ביולוגי לכל מתח).
IDBac הוא כלי להבדיל במהירות מאוד הקשורים בקטריאלי בהתבסס על מידע מטקמיים וייצור מטבוליזם המקצועית. זה יכול להשלים או לשמש כמבשר לשיטות אורתוגונאליות כגון ניתוחים גנטיים מעמיק, מחקרים הכרוכים בייצור מטבוליזם ותפקוד, או אפיון של מבנה מטבוליט מיוחדים על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית ו/או LC-MS/MS.
ייצור מטבוליזם המקצועית (IDBac מאנס) הוא פגיע מאוד לתנאי גידול חיידקי, במיוחד באמצעות מדיה שונים, אשר היא מגבלה פוטנציאלית של השיטה. עם זאת תכונות אלה ניתן לנצל על ידי המשתמש, כמו IDBac יכול בקלות ליצור מאמינים מראה את ההבדלים בייצור מטבוליזם המקצועית תחת מגוון רחב של תנאי גדילה. חשוב לציין כי בעוד טביעות אצבעות מיוחדים מטבוליזם עשוי להשתנות בתנאי הצמיחה, הצגנו בעבר כי טביעות אצבע של חלבונים נשארים יציבים יחסית על פני משתנים אלה (ראה קלארק ואח ‘6). כאשר מתעסקים עם לוחות מגוון סביבתי, אנו ממליצים לטהר מבודד חיידקי לפני ניתוח כדי להפחית את התרומות האפשריות מפני שכנים בקטריות שכנות.
לבסוף, חוסר במאגר המידע הציבורי הניתן לחיפוש של טביעות אצבעות של חלבון MS הוא קיצור מרכזי המגיע השימוש בשיטה זו כדי לסווג חיידקים סביבתיים לא ידועים. יצרנו idbac עם זה בראש, וכללה המרה אוטומטית של נתונים לתוך פורמט מקובל הקהילה קוד פתוח (mzml)10,11,12 ועיצב את התוכנה כדי לאפשר חיפוש, שיתוף, ויצירה של מסדי נתונים מותאמים אישית. אנחנו בתהליך של יצירת מסד נתונים ציבורי גדול (> 10000 מאופיין במלואו), אשר יאפשר סיווג של כמה בודד לרמת המינים, כולל קישורים למספרי ההצטרפות של GenBank כאשר הם זמינים.
IDBac הוא מקור פתוח והקוד זמין עבור כל אחד כדי להתאים אישית את הצרכים שלהם ניתוח נתונים והדמיה. אנו ממליצים למשתמשים להתייעץ עם גוף ספרות נרחב (זאואר ואח ‘7, סילבה et al.5) כדי לסייע בתמיכה ובעיצוב המטרות הנסיוניות שלהם. אנו מארחים פורום לדיון ב: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac ואמצעים כדי לדווח על בעיות עם התוכנה ב: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי המכון הלאומי של מדעי הרפואה הכללית גרנט R01 GM125943, נשיונל ג’יאוגרפיק CP-044R-17; מלגת קרן המחקר האיסלנדי 152336-051; ואוניברסיטת אילינוי. בקרנות האתחול של שיקגו כמו כן, אנו מודים לתורמים הבאים: ד ר אמנדה בולמן לקבלת סיוע בפרמטרים לרכישת חלבונים באמצעות מלנדי-תוף MS; ד ר טרי מור וד ר מריה ג’יין עבור התקן אלפא-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה מטריקס (CHCA).
Materials
| Acetonitrile | Fisher | 60-002-65 | LC-MS Ultra CHROMASOLV |
| Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument | Bruker Daltonics | ||
| Bruker Daltonics Bacterial test standard | Fisher | NC0884024 | Bruker Daltonics 8604530 |
| Bruker Peptide Calibration standard | Fisher | NC9846988 | Bruker Daltonics 8206195 |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | 99.5+%, Optima LC/MS Grade |
| MALDI-TOF target Plate | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemical | A456-500 | Optima LC/MS Grade |
| Toothpicks | any is ok | ||
| Trifluoroacetic acid | Fisher | AC293810010 | 99.5%, for biochemistry, ACROS Organics |
| Water | VWR | 7732-18-5 | LC-MS |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | (C2020-25G) ≥98% (TLC), powder |
References
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
- Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).
- Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).
- Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists. Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).
- Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis. Planta Medica. 82, 671-689 (2016).
- Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).
- Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).
- Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., Böttger, E. C., Hombach, M. Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).
- Schumann, P., Maier, T. MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria. Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).
- Chambers, M. C., Maclean, B., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).
- Martens, L., Chambers, M., et al. mzML-a community standard for mass spectrometry data. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).
