Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы
Summary
Здесь мы представляем протокол для оценки маркировки однородности для каждого вида белка в образце комплекс белков на уровне одной молекулы.
Abstract
Клетки протеомов часто характеризуется с помощью электрофореза анализов, где все виды белков в клетках не специально помечены Люминесцентную краску и запятнан фотоприемник после их разъединения. Одной молекулы флуоресценции изображений может обеспечить обнаружение сверхчувствительная белка с его способностью для визуализации отдельных флуоресцентных молекул. Однако применение этого мощного изображений метода для электрофореза анализов препятствует отсутствие способов охарактеризовать однородности люминесцентные маркировки каждого вида белка через протеома. Здесь мы разработали метод оценки маркировки однородности через протеом, основанный на одной молекулы флуоресценции изображений assay. В нашей измерения, используя образец клеток HeLa, доля белков, помечены по крайней мере одна краска, которой мы «размещение маркировки» (LO), было установлено в диапазоне от 50% до 90%, поддерживая высокий потенциал применения одной молекулы изображений для анализ чувствительным и точным протеома.
Introduction
Протеома анализ, который призван определить весь набор белковых молекул, выраженные в ячейке, является ценным подход в текущих биологических и медицинских исследований. Этот анализ обычно полагается на масс-спектрометрии, который идентифицирует видов белков, основанный на спектры, порожденных через белка ионизации1,2,3. Альтернативный метод для анализа протеома-электрофорез, включая электрофореза геля полиакриламида (страница), капиллярного электрофореза и двухмерные (2D) гель-электрофорез. Этот метод полагается на неспецифические люминесцентные маркировки всех белковых молекул в анализируемом клетках, следуют электрофоретического разделения и обнаружения и количественного определения каждого вида белка. Для достижения требуемых неспецифических белков маркировки, одна из стратегий заключается в использовании флуоресцентных красителей, которые могут связываться с белками через электростатический и гидрофобных взаимодействий, например Кумасси синим и рубиново-Sypro4,5,6 . Альтернативная стратегия заключается в использовании ковалентных маркировки с красителями, содержащих эфира N-оксисукцинимидного (NHS) или maleimide, который можно ковалентно связывать белков через общие остатков таких первичных аминов и тиолы, соответственно7, 8.
Тем временем чувствительность флуоресценции обнаружения идеально подходит для анализа низкой обилие протеинов и небольшое количество клеток. Одной молекулы флуоресценции изображений является одним из наиболее чувствительных методов, что позволяет обнаружения отдельных флуоресцентных красителей и обозначенные протеины в пробирке и в естественных условиях9,10,11,12, 13,14,15. Ожидается, что применение этого метода визуализации для анализа на основе электрофорез протеома включить весьма деликатного и количественных анализов, считая индивидуальных белков-дневно обозначенных. Однако остается неясным, является ли маркировки с флуоресцентными красителями достаточно однородной во всех белковых молекул, и как эта однородность зависит от видов различных белков (рис. 1). Простые решения массовых измерений могут использоваться для получения молярное соотношение флуоресцентных красителей белков под названием «муфты эффективность»8 или «маркировки эффективности», но это свойство не содержится информации о однородность маркировки среди белковых молекул.
Здесь мы описываем протокол assay расследовать маркировки однородности для всех видов белка в ячейку (рис. 2)16. Два ключевых шагов этот assay очищение протеина и изображений. На первом шаге дневно помечены всех белков в клетках и биотинилированным, затем извлекали отдельно с помощью электрофореза геля следуют electroelution. На втором шаге флуоресценции свойства отдельных белковых молекул в извлеченной образцы оцениваются на основе изображений одной молекулы. Из этих данных, параметры, важные для подсчета анализа, такие, как процент белков помечены с по крайней мере одно краситель, который мы называем маркировки размещение (LO)16, и среднее количество флуоресцентных красителей привязаны к одной белковой молекулы (n̄ краска), можно охарактеризовать. В протоколе оптимизированная процедура для маркировки клеток HeLa протеома краской NHS основе цианиновые 3 (Cy3) представлена в качестве примера и может быть изменен с другими маркировки процедур согласно желаемой исследовательских целей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот документ описывает протокол для количественного определения маркировки однородности каждого вида помечены белка в клетках после разделения с SDS-PAGE (шаг 3). Метод разделения может быть заменен с другими методами, такими как жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза, ко…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Масаэ Ohno и Нисимура Кадзуя для экспериментальной помощь и консультации. Эта работа была поддержана PRESTO (JPMJPR15F7), Япония агентство по науке и технологии, дотаций для молодых ученых (A) (24687022), сложных поисковых исследований (26650055) и научных исследований в инновационных областях (23115005), общество Японии Продвижение науки и гранты от фонда науки Такэда и Mochida Мемориальный фонд для медицинских и фармацевтических исследований. С.л. признает поддержку от программы RIKEN международной программы связать (IPA).
Materials
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer – D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
- Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
- Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
- Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
- Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
- Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).
- Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
- Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
- Ian Freshney, R. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Sternberg, Biomedical Image Processing. Computer. 16 (1), 22-34 (1983).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
- Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).
- Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
- Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
- Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).
