Fluxo Cytometric medição da produção de ROS em macrófagos em resposta a FcγR cross-linking

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas reativas ou radicais livres que são subprodutos da respiração aeróbia (revisto em ¹). Estes incluem o anião superóxido, peróxido, peróxido de hidrogênio, radical hidroxila e íons de hidroxila, entre outros. Em condições fisiológicas normais, ROS são produzidos principalmente pelas mitocôndrias e oxidases de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) e são rapidamente desintoxicados por diversas enzimas e proteínas como a superóxido dismutase e glutationa. Uma produção exagerada de ROS ou um defeito na capacidade de remover ROS pode resultar em estresse oxidativo, no qual espécies reactivas de oxigénio promovem os danos de proteínas, lipídios e DNA, levando ao estresse celular ou morte e Estados de doença patológica. No entanto, atualmente é apreciado que ROS também pode atuar como moléculas sinalizadoras (sinalização redox), e mediada por ROS modificação de várias moléculas e via intermediários pode influenciar o metabolismo celular, proliferação, sobrevivência, inflamatória sinalização e envelhecimento². Em células fagocíticas, ROS desempenha um papel essencial no fornecimento de atividade antimicrobiana durante a chamada “explosão respiratória”^1,3,4,5,6. Durante a resposta dos fagócitos a estímulos externos, componentes da oxidase NADPH complexo (p40^phox, p47^phox, p67^phox) translocar do citosol para a membrana phagosomal, que contém a gp91phox e p22phox subunidades, e juntamente com as ações do Rac1/2, formam um totalmente funcional NADPH oxidase complexo enzimático. A oxidase de NADPH montado então utiliza NADPH para reduzir o oxigênio ao superóxido dentro do vacúolo phagosomal. Ânions superóxido diretamente podem causar danos ou ser dismutated em peróxido de hidrogênio. Tanto o superóxido e o peróxido de hidrogênio podem reagir com outras moléculas para gerar radicais hidroxila altamente reativos. Dano é mediado por reação destas ROS com proteínas ferro-enxofre ou causando oxidação base de DNA, conduzindo finalmente ao metabolismo microbiano restrito ou morte do micróbio⁵. A importância da enzima oxidase NADPH complexa e ROS produzidos durante a explosão respiratória é ilustrado clinicamente em pacientes com doença granulomatosa crônica (CGD)^{7,8,9, 10}. indivíduos com CGD possuem mutações em gp91phox, resultando em uma falta de produção de ROS e susceptibilidade a infecções com bactérias e fungos que normalmente não são uma preocupação com os indivíduos imunocompetentes. Portanto, se estudar oxidativo estresse, sinalização redox ou defesa do hospedeiro, sendo capaz de medir a produção de ROS em tempo real é um esforço útil.

Vários ensaios têm sido utilizados para a produção de ROS de medida ou os resultados do stress oxidativo^11,12,13. Entre estes, um do mais amplamente utilizado é a sonda fluorescente 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacetato (Diniz Melo₂-DA)¹⁴. Esta molécula é lipofílico e incolor. Difusão de Diniz Melo₂-DA através da membrana celular permite a ser postas em prática por esterases intracelulares, que deacetylates-lo em Diniz Melo_2, tornando-se células impermeáveis. As ações de vários tipos de ROS (peróxido de hidrogênio, peroxinitrito, radicais hidroxila, óxido nítrico e radicais de peróxido) na Diniz Melo₂ -oxidam em DCF, que é fluorescente (relatado Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) e pode ser detectada usando um fluxo citômetro equipado com um filtro padrão definido para fluoresceína (FL1 canal). Superóxido pode reagir com outra sonda dihydroethidium (DHE) para produzir o produto fluorescente 2-hydroxyethidium (bem como outros produtos de oxidação de superóxido independente fluorescente)¹⁵, mas não reage fortemente com Diniz Melo₂ . Produtos de oxidação DHE fluorescentes podem ser detectados usando um comprimento de onda de excitação de 518 nm e um comprimento de onda de emissão de 605 nm (canal FL2). Embora relativamente simples de usar, a utilização de tais sondas para a deteção de ROS requer conhecimento de suas limitações e cuidadosa incorporação de coloração procedimentos e controles para o ensaio específico, sendo realizado a fim de ter válido experimental resultados e conclusões. O protocolo a seguir demonstra o uso de um kit disponível comercialmente, empregando estes 2 sondas projetadas para medir ROS por citometria de fluxo. Podemos manchar aprontados macrófagos derivados da medula óssea com estas sondas e induzir a produção de ROS através do cross-linking FcγR. Apresentamos dados representativos obtidos usando este protocolo e sublinhar as devidas precauções que devem ser empreendidas para experimentação bem sucedida.