선생님 FcγR Cross-linking에 대 식 세포에서 생산의 흐름 Cytometric 측정
Summary
이 연구는 cytometry 반응성 산소 종 (선생님) 생산은 FcγR의 활성화에서 결과 검색의 사용을 보여줍니다. 항균 및 산화 환 원 신호 면역성이 있는 복합물, opsonized 미생물, 또는 직접 FcγR cross-linking에 식 세포의 기능을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.
Abstract
산화 또는 호흡기 버스트는 다양 한 면역 자극에 응답 식 세포에 의해 산소의 급속 한 소비와 반응성 산소 종 (ROS)의 발생을 설명 하기 위해 사용 됩니다. 선생님 면역 활성화 중 생성 된 미생물의 죽음을 일으키는 주로 손상 DNA와 단백질, 선생님의 능력을 통해 강력한 항균 활성을 발휘 한다. Reproducibly 고 쉽게 선생님 생산을 측정할 수 있는 다양 한 경로 호스트 방어의이 메커니즘을 분자의 기여를 평가 하기 위해 필요 하다. 이 종이에 우리 형광 프로브의 사용과 cytometry 선생님 생산 검색 합니다. 널리 사용 되지만, 선생님의 형광 측정 특정 하지 mitogenic 자극에 의해 유도 된 선생님의 측정에 관하여 특히 악명 높게 문제 이다. 우리는 대 식 세포 생성, 못쓰게, 얼룩, FcγR 교차 연결, 및 결말 흐름 cytometric 분석 시작 특정 FcγR 자극 결과로 생성 된 선생님을 감지 하는 상세한 방법론 제시.
Introduction
반응성 산소 종 (선생님)는 반응 분자 또는 호 기성 호흡 ( 1에서검토)의 부산물입니다 자유 래 디 칼. Superoxide 음이온, 과산화 수소, 과산화 수소, 수 산 기 과격 한, 그리고 수 산 기 이온, 다른 사람의 사이에서 포함 됩니다. 정상적인 생리 적인 조건 하에서 선생님 미토 콘 드리 아와 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (NADPH) oxidases에 의해 주로 생성 하 고 다양 한 효소와 단백질 superoxide dismutase, glutathione 등 여 detoxified 빠르게. 선생님 또는 선생님을 제거 하는 기능에 결함의 과장 된 생산 산화 스트레스, 반응성 산소 종 단백질, 지질, 및 세포 스트레스 또는 죽음 및 병 적인 질병 상태를 선도 하는 DNA의 손상을 촉진 하는 그것에 의하여 발생할 수 있습니다. 그러나, 그것은 현재 감사 선생님 수 있습니다. 신호 분자 (산화 환 원 신호), 또한 역할을 하 고 다양 한 분자 및 통로 중간체의 수정 선생님 중재 세포질 물질 대사, 증식, 생존, 선 동적인 영향을 미칠 수 있습니다. 신호, 그리고2노화입니다. Phagocytic 세포에서 선생님 소위 “호흡 파열”1,,34,,56동안 항균 성 활동을 제공 하는 필수적인 역할을 재생 합니다. 식 세포의 외부 자극에 응답, 동안에 NADPH 산화 효소 복잡 한 (p40phox, p47phox, p67phox)의 구성 요소 포함 하는 gp91phox 및 p22phox phagosomal 막에는 cytosol에서 이동 소 단위, 완전 하 게 작동 NADPH 산화 효소 효소 복잡 한 형성 Rac1/2의 작업을 함께. 조립된 NADPH 산화 효소는 다음 NADPH 산소 phagosomal 공포 시간 초과를 줄이기 위해 활용 합니다. Superoxide 음이온 직접 손상 될 수 있습니다 또는 과산화 수소에 dismutated. 초과 과산화 수소는 반응성이 매우 높은 수 산 기 급진 파를 생성 하는 다른 분자와 반응 수 있습니다. 손상 또는 제한 된 미생물 물질 대사 또는 미생물5의 죽음을 선도 하는 궁극적으로 DNA의 기본 산화를 발생 하 여 철-황 단백질에 클러스터와이 선생님의 반응에 의해 중재 됩니다. 복잡 한 NADPH 산화 효소 효소의 중요성 및 호흡기 버스트 동안 생산 하는 선생님은 삽화가 임상 환자 만성 Granulomatous 질병 (CGD)7,,89, 10. CGD와 개인 소유 gp91phox에서 돌연변이 선생님 생산 및 박테리아와 균 류는 보통 immunocompetent 개인 관심사는 재발 감염 민감성의 부족의 결과. 따라서, 공부 하는 산화 스트레스, 산화 환 원 신호, 또는 호스트 방어 되 고 측정할 수 있는지 여부를 실시간으로 선생님 생산 유용한 노력 이다.
여러 분석 실험 측정 선생님 생산 또는 산화 스트레스11,,1213의 결과 이용 되어 있다. 이러한 가운데, 중 가장 널리 사용 되는 형광 프로브 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH2-다)14. 이 분자는 무색이 고 질 성. DCFH2-다 세포 막에 걸쳐 확산이 있습니다 세포내 esterases에 의해 위에 행동 될 DCFH2, 스며들 지 않는 셀 렌더링으로 deacetylates는. 선생님 (과산화 수소, peroxynitrite, 수 산 기 유리 기, 산화 질소 및 peroxy 급진 파) DCFH2 에 여러 종류의 작업은 형광 DCF로 산화 (전 보고 / Em: 485-500 nm/515-530 nm)는 흐름을 사용 하 여 감지할 수 있습니다 cytometer fluorescein (FL1 채널)에 대 한 설정 하는 표준 필터 장착. Superoxide는 DCFH2 와 강하게 반응 하지 않습니다 하지만 다른 프로브 dihydroethidium (DHE) 형광 제품 2-hydroxyethidium (뿐만 아니라 다른 형광 superoxide 독립적인 산화 제품)15를 반응 수 있습니다. DHE 산화의 형광 제품 518의 여기 파장을 사용 하 여 검출 될 수 있다 및 605의 방출 파장 nm (FL2 채널). 하지만 비교적 사용이 간단, 선생님의 검출에 대 한 이러한 프로브 활용 그들의 한계의 지식 및 얼룩이 지기의 절차 및 컨트롤에 유효한 있기 위하여 수행 되 고 특정 분석 결과 실험 주의 설립 필요 합니다. 결과 및 결론입니다. 다음 프로토콜 채용이 2 프로브 cytometry 여 선생님을 측정 하도록 설계 되어 상용 키트의 사용을 보여줍니다. 우리는 이러한 프로브 끝났다 골 수 유래 세포를 얼룩이 고 FcγR cross-linking 통해 선생님 생산 유도. 우리는이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 대표적인 데이터 제시 하 고 성공적인 실험을 위해 착수 해야 하는 적절 한 예방 조치를 강조.
Protocol
Representative Results
Discussion
DCFH2-다 고 선생님의 DHE 기반 탐지 기술은 널리 사용14,15입니다. 사용의 용이성과 이러한 선생님 프로브 키네틱 microplate 형식에 대 한 적응성, 형광 현미경 검사 법 또는 흐름 cytometric 분석은 그들의 인기에 기여 했다. 그러나, 우리의 연구에서 FcγR 중재 하는 대 식 세포 기능, 거기 보이지 않았다 될 FcγR 상호 연결 된 셀의 흐름 cytometric 분석을 위?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Madelyn H. 밀러, 등 오마르 카 르도 나, Andjie Jeudy, Roopin 싱 실험실 유지와 마우스 식민지 유지 관리에 그들의 도움에 대 한 Tigno-아 랑 페 즈 연구소의 다른 회원 들에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 연구에 대 한 지원 그랜트 R00 HL122365와 J.T.T-a 시작 자금에 의해 제공 된
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
- Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
- Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
- Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
- Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
- Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
- Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
- Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
- Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
