巨噬细胞 ros 产生的流式细胞仪测量对 fcγr 交联的响应

活性氧 (ros) 是活性分子或自由基, 是有氧呼吸的副产品 (^{综述在 1})。其中包括超氧化物阴离子、过氧化物、过氧化氢、羟基自由基和羟基离子等。在正常的生理条件下, ros 主要由线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (nadph) 氧化酶产生, 并由超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等多种酶和蛋白质快速解毒。ros 的夸大产生或去除 ros 能力的缺陷会导致氧化应激, 其中活性氧物种会促进蛋白质、脂质和 dna 的损害, 导致细胞应激或死亡和病理疾病状态。然而, 目前人们认识到 ros 也可以作为信号分子 (氧化还原信号), 而 ros 介导的各种分子和途径中间体的修饰可以影响细胞代谢、增殖、生存、炎症信号, 和老化²。在吞噬细胞中, ros 在提供所谓的 “呼吸爆裂”^{1、3、4、5、6}期间发挥着至关重要的作用。在吞噬细胞对外部刺激的反应中, nadph 氧化酶复合物 (^{p40 phox}、p40^phox、p40^phox) 的成分从细胞溶胶转移到含有 gp91 phox 和 p22phox 的吞噬膜上亚基, 并与 rac半的行动, 形成一个全功能的 nadph 氧化酶复合物。然后, 组装的 nadph 氧化酶利用 nadph 将氧气还原为脂肪体液泡内的超氧化物。超氧化物阴离子可直接造成损害或分解成过氧化氢。超氧化物和过氧化氢都可以与其他分子发生反应, 产生高活性的羟基自由基。损伤是由这些 ros 与蛋白质上的铁硫簇反应或导致 dna 的碱基氧化来介导的, 最终导致微生物代谢受限或微生物⁵死亡。在慢性肉芽肿病 (cgd)^7, 8, 9,¹⁰. 患有 cgd 的个体在 gp91phox 中具有突变, 导致缺乏 ros 的产生, 并容易受到细菌和真菌的反复感染, 而细菌和真菌通常与免疫能力的个人无关。因此, 无论是研究氧化应激、氧化还原信号, 还是宿主防御, 能够实时测量 ros 的产生都是一个有益的尝试。

多项检测已被用来测量 ros 的产生或氧化应激^{的结果 11,12,13}。其中, 其中最广泛使用的是荧光探针 2 ‘, 7 ‘ 二氯氢荧光素二乙酸 (dcfh 2-da)¹⁴.这种分子是无色和亲脂性的。dcfh-da 在细胞膜上的扩散使其能够通过细胞内酯酶作用, 从而将其转化为 dcfh₂ , 使其具有不渗透性。多种类型的 ros (过氧化氢、过氧亚硝酸盐、羟基自由基、一氧化氮和过氧自由基) 在 dcfh₂上的作用将其氧化为荧光的 dcf (报告为 exsem:485-500 nm\ 15-530 nm), 并可通过流量检测细胞仪配备了荧光素 (fl1 通道) 的标准过滤器集。超氧化物与 dcfh_{2 不}强烈反应, 但可与另一种探针二氢乙二酸 (dfe) 反应, 产生荧光产物 2-羟基乙酸 (以及其他与荧光超氧化物无关的氧化产物)^15.使用518纳米的激发波长和 605 nm (fl2 通道) 的发射波长可以检测到 dfe 氧化的荧光产物。虽然使用起来相对简单, 但要利用这些探针检测 ros, 需要了解它们的局限性, 并仔细地将染色程序和控制纳入正在进行的具体检测中, 以便有有效的实验结果和结论。下面的协议演示了使用商用套件的方法, 该套件采用了这两个探头, 用于流式细胞仪测量 ros。用这些探针染色引种骨骨髓衍生的巨噬细胞, 通过 fcγr 交联诱导 ros 的产生。我们提供了使用该协议获得的具有代表性的数据, 并强调了成功试验必须采取的适当预防措施。