تدفق سيتوميتريك قياس الإنتاج روس في الضامة ردا على FcγR العابرة للربط
Summary
وتوضح هذه الدراسة استخدام التدفق الخلوي للكشف عن إنتاج الأنواع (روس) الأكسجين التفاعلية الناجمة عن تفعيل FcγR. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتقييم التغييرات في مضادات الميكروبات والأكسدة والاختزال مما يشير إلى وظيفة البالعات ردا على مجمعات محصنة، والكائنات المجهرية أوبسونيزيد، أو العابرة للربط FcγR مباشرة.
Abstract
انفجر الجهاز التنفسي أو الأكسدة المستخدمة في وصف الاستهلاك السريع للأوكسجين، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) البالعات في الاستجابة للمحفزات المناعية المختلفة. روس التي تم إنشاؤها أثناء عملية التنشيط المناعي تمارس نشاط مضادات الميكروبات القوية أساسا من خلال قدرة روس على إتلاف الحمض النووي والبروتينات، مما تسبب في وفاة من الكائنات الحية الدقيقة. أن تكون قادرة على قياس إنتاج روس تكاثر ومع سهولة ضروري من أجل تقييم إسهام مختلف المسارات والجزيئات إلى هذه الآلية للدفاع المضيف. في هذه الورقة، ونحن تثبت استخدام المسابير الفلورسنت والتدفق الخلوي للكشف عن إنتاج روس. على الرغم من أن تستخدم على نطاق واسع، قياس الفلورسنت من روس المعروف إشكالية، لا سيما فيما يتعلق بقياس روس الناجم عن حوافز محددة ولا ميتوجينيك. نقدم منهجية مفصلة للكشف عن روس المتولدة نتيجة تنشيط FcγR محددة بدءاً من جيل بلعم فتيلة وتلطيخ، FcγR العابرة للربط، وتنتهي مع تحليل تدفق سيتوميتريك.
Introduction
الأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) هي جزيئات التفاعل أو الجذور الحرة التي هي الآثار الجانبية للتنفس الهوائي (استعرض في 1). وتشمل هذه انيون دسموتاز، بيروكسيد، بيروكسيد الهيدروجين، هيدروكسيل متطرفة، وأيونات الهيدروكسيل، بين أمور أخرى. الظروف الفسيولوجية العادية، تنتج أساسا من الميتوكوندريا ونيكوتيناميد الأدنين dinucleotide الفوسفات (NADPH) أوكسيداسيس روس وهي سرعة سميته بمختلف الإنزيمات والبروتينات مثل الفاءق دسموتاز والجلوتاثيون. يمكن أن يؤدي إنتاج مبالغ فيها من روس أو خلل في القدرة على إزالة روس الأكسدة، حيث تشجع الأنواع الأكسجين التفاعلية الضرر من البروتينات والدهون والحمض النووي مما يؤدي إلى إجهاد الخلوية أو الموت والمرض المرضية الدول. ومع ذلك، فإنه حاليا يقدر أن روس ويمكن أيضا بمثابة إشارات الجزيئات (إشارة الأكسدة والاختزال)، ويمكن أن تؤثر بوساطة روس تعديل مختلف الجزيئات والمواد الوسيطة المسار الأيض الخلوي، والانتشار، البقاء على قيد الحياة، التهاب إشارات، والشيخوخة2. روس في خلايا متجولة، دوراً أساسيا في توفير نشاط مضادات الميكروبات أثناء ما يسمى “انفجر الجهاز التنفسي”1،3،4،،من56. خلال استجابة البالعات للمنبهات الخارجية، ترانسلوكاتي مكونات أوكسيديز نادف المعقدة (p40phox, p47 بطاقات مجانيةphox، p67phox) من سيتوسول للغشاء فاجوسومال الذي يحتوي على gp91phox و p22phox الوحدات الفرعية، وجنبا إلى جنب مع إجراءات Rac1/2، تشكل إنزيم أوكسيديز نادف تعمل بكامل طاقتها معقدة. ثم يستخدم أوكسيديز نادف المجمعة نادف لتقليل الأكسجين إلى فائق أكسيد داخل المنقبضة فاجوسومال. فائق أكسيد الأنيونات مباشرة يمكن أن يسبب ضررا أو أن ديسموتاتيد إلى فوق أكسيد الهيدروجين. فائق أكسيد وفوق أكسيد الهيدروجين يمكن أن تتفاعل مع الجزيئات الأخرى لتوليد جذور الهيدروكسيل عالي التفاعل. هو وساطة الأضرار برد فعل هذه روس مع كتل الحديد-الكبريت في البروتينات أو بالتسبب في قاعدة أكسدة الحمض النووي، ويؤدي في النهاية إلى الأيض الميكروبي مقيد أو الموت ل ميكروب5. وتتجلى أهمية إنزيم أوكسيديز نادف المعقدة وروس أنتجت خلال انفجار الجهاز التنفسي سريرياً في المرضى الذين يعانون من المرض الحبيبي المزمن (رودمان)7،،من89، 10-تملك الأفراد مع رودمان الطفرات في gp91phox، أسفر عن نقص في إنتاج روس والقابلية للالتهابات المتكررة مع البكتيريا والفطريات التي ليست عادة اهتمام بالأفراد الأشخاص. ولذلك، ما إذا كانت دراسة يجري عنصر مؤكسد الإجهاد أو إشارة الأكسدة والاختزال أو الدفاع المضيف، قادرة على قياس إنتاج روس في الوقت الحقيقي مسعى مفيدة.
وقد استخدمت فحوصات متعددة لقياس إنتاج روس أو نتائج الأكسدة11،،من1213. ومن بين هذه، واحدة من الأكثر استخداماً هو مسبار فلورسنت 2 ‘، 7’ ديتشلوروديهيدروفلوريسسين اسيتات (دكفه2-دا)14. هذا الجزيء عديم اللون ومحبتين. نشر دكفه2-دا عبر غشاء الخلية يسمح لها بأن تبت esterases داخل الخلايا، التي ديسيتيلاتيس إلى دكفه2، جعلها الخلية غير منفذة. الأعمال التي تقوم بها أنواع متعددة من روس (فوق أكسيد الهيدروجين، بيروكسينيتريتي وجذور الهيدروكسيل، وأكسيد النيتريك وأكسي الجذور) في دكفه2 أكسدة أنه في منتدى التعاون الإنمائي هو الفلورسنت (المبلغ عنها سابقا/م: 485-500 نانومتر/515-530 نانومتر) ويمكن الكشف عنها باستخدام تدفق سيتوميتير مجهزة بعامل تصفية قياسية المحددة ل fluorescein (قناة FL1). فائق أكسيد لا تتفاعل بشدة مع دكفه2 ولكن يمكن أن تتفاعل مع آخر مسبار ديهيدروثيديوم (DHE) أن تسفر عن المنتج فلورسنت 2-هيدروكسيثيديوم (فضلا عن سائر المنتجات الفلورسنت مستقلة عن فائق أكسيد الأكسدة)15. منتجات أكسدة DHE الفلورسنت يمكن الكشف عنها باستخدام الطول موجي إثارة 518 شمال البحر الأبيض المتوسط وطول موجي انبعاثات من 605 نانومتر (قناة FL2). على الرغم من أن بسيطة نسبيا لاستخدام والاستفادة من هذه التحقيقات للكشف عن روس يتطلب المعرفة بقصورها وإدماج حذراً من تلطيخ الإجراءات والضوابط في المقايسة محددة يجري تنفيذها لصالح التجريبية والنتائج والاستنتاجات. البروتوكول التالي يوضح استخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً توظيف هذه المسابر 2 مصممة لقياس روس بالتدفق الخلوي. نحن وصمة عار معبي الضامة المشتقة من نخاع العظام بهذه التحقيقات والحث على إنتاج روس عن طريق FcγR العابرة للربط. يقدم الممثل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول، ونؤكد الاحتياطات الملائمة التي يتعين اتخاذها لإجراء التجارب الناجحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
دكفه2-دا والكشف على أساس DHE من روس هو14،تقنية المستخدمة على نطاق واسع15. سهولة الاستخدام وتكيف هذه المسابر روس للأشكال الميكروسكوبية الحركية، ساهم التحليل سيتوميتريك المجهري أو تدفق الأسفار شعبيتها. ومع ذلك، في دراساتنا لوظائف FcγR بوساطة بلعم، هناك لا ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر الأعضاء الآخرين في “المختبر” تينو ارانخويث بمن فيهم مادلين H. ميلر وعمر كاردونا، جودي أنجي وروبين سينغ لمساعدتهم في مختبر الماوس وصيانتها صيانة مستعمرة. وقدم الدعم لهذا البحث بمنحه R00 HL122365 وأموال بدء التشغيل إلى J.T.T-أ.
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
- Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
- Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
- Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
- Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
- Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
- Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
- Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
- Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
